Molekulare Charakterisierung des Gens des Sporenwandproteins von Encephalitozoon hellem durch inverse und verankerte Polymerasekettenreaktion

Der labordiagnostische Nachweis von Mikrosporidieninfektionen
bereitet noch immer Probleme. Aufgrund ihrer geringen Größe und
ihrer unspezifischen Färbeeigenschaften ist der lichtmikroskopische
Direktnachweis schwierig. Der elektronenmikroskopische Nachweis ist
aufwendig und insbesondere aus Stuhl wenig sensitiv. Nicht alle
Mikrosporidien können in Zellkulturen vermehrt werden. Die beim
Menschen häufigste Spezies, Enterocytozoon bieneusi, ist nicht
kultivierbar. Molekularbiologische Nachweisverfahren wie die PCR
sind ebenfalls aufwendig, noch nicht standardisiert und derzeit
noch Speziallaboratorien vorbehalten. Zuverlässige
immundiagnostische Tests mit ausreichender Sensitivität und
Spezifität fehlen insbesondere für E. bieneusi, da aufgrund der
fehlenden Kultivierbarkeit die für eine Testentwicklung nötige
Menge und Reinheit des Antigens kaum zu erzielen ist. Gene, durch
deren rekombinante Expression dieses Problem gelöst werden könnte,
sind bisher noch nicht bekannt. Dabei wäre zum Beispiel die
Entwicklung eines Koproantigen-ELISA zum Nachweis von E. bieneusi
aus Stuhl von großem praktischem Nutzen. Ziel der hier vorgelegten
Arbeit war es, die Voraussetzungen hierfür zu verbessern. Als
aussichtsreichstes Antigen wurde das so genannte
„Sporenwandprotein“ (SWP) gewählt, der Hauptbestandteil der
Sporenwand von Mikrosporidien. In eigenen Vorarbeiten konnte
gezeigt werden, dass es allerdings wenig aussichtsreich ist,
alleine anhand der bis dahin ausschließlich für Encephalitozoon
cuniculi und E. intestinalis bekannten SWP-Gensequenzen PCR-Primer
zur Amplifikation des homologen Gens aus E. bieneusi zu
konstruieren. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit zunächst der
bis dahin unbekannte, vollständige kodierende Bereich des SWP-Gens
einer weiteren Encephalitozoon-Spezies, E. hellem, einschließlich
benachbarter Genabschnitte auf Nukleinsäureebene charakterisiert.
Durch die Vergleichsmöglichkeit mit dem SWP-Gen einer dritten
Mikrosporidienart wurden die Voraussetzungen zur Konstruktion
„universeller“ Primer, die homologe Abschnitte des wahrscheinlich
auch in E. bieneusi vorhandenen SWP-Gens amplifizieren können,
verbessert. Ein weiteres Ziel, das in dieser Arbeit erreicht wurde,
war bei dieser Charakterisierung ganz auf das Anlegen von Banken zu
verzichten. Im Hinblick auf die fehlende Kultivierbarkeit von E.
bieneusi und die damit verbundene Schwierigkeit, das
Ausgangsmaterial für genomische oder cDNA-Banken (genomische DNA
bzw. mRNA) in ausreichender Menge und Reinheit zu gewinnen, sollte
nämlich bewiesen werden, dass es möglich ist, das SWP-Gen einer
Mikrosporidienart alleine durch die Anwendung von PCR-Techniken
bestimmen zu können. Als Ausgangspunkt für die Charakterisierung
des SWP-Gens aus E. hellem war die Amplifizierung eines ersten
Genfragments. Dies konnte durch die Konstruktion so genannter
„degenerierter“ Primer (Primermischungen) erreicht werden. Nach
Kenntnis dieser ersten E. hellem-spezifischen DNA-Sequenz konnten
anschließend Primer konstruiert werden, die vollständig zum SWP-Gen
von E. hellem passten. In einer „klassischen“ PCR können jedoch nur
DNA-Abschnitte zwischen bekannten Bereichen amplifiziert werden, da
diese zur Konstruktion der beiden PCR-Primer bekannt sein müssen.
Um dennoch die DNA-Sequenz aus dem ersten Genfragment nach beiden
Seiten („upstream“ und „downstream“) verlängern zu können, wurden
„inverse“ und „verankerte“ PCR-Reaktion als Spezialtechniken
eingesetzt und durch Kombination mit bekannten Techniken
(„geschachtelte“, „halb-geschachtelte“ und „Touch Down“-PCR)
optimiert. Schließlich wurden in der vorliegenden Arbeit aus der
Primärstruktur (Nukleotidabfolge) ableitbare Eigenschaften des
SWP-Gens von E. hellem diskutiert. Durch Sequenzvergleich mit den
bereits bekannten SWP-Genen aus E. cuniculi und E. intestinalis
wurden zwei konservierte Loci identifiziert, die zur Konstruktion
„universeller“ SWP-Primer vorgeschlagen werden. In der vorliegenden
Arbeit wurde somit (a) das bis dahin unbekannte Gen des
Sporenwandproteins aus E. hellem erstmals auf Nukleotidebene
charakterisiert, (b) bewiesen, dass die Charakterisierung eines
unbekannten SWP-Gens durch ausschließliche Anwendung von
PCR-Spezialtechniken und ohne die Herstellung von genomischen oder
cDNA-Banken möglich ist und (c) Methoden der „inversen“ und der
„verankerten“ PCR in der Arbeitsgruppe etabliert und optimiert.