Bestimmung der regionalen Organdurchblutung mit Hilfe von fluoreszierenden Mikrosphären

Zusammenfassung Einleitung Mikrosphären (MS) gelten als
Standardmethode zur Messung des regionalen Blutflusses. Hierzu
werden MS linksatrial injiziert. Sie verteilen sich dann im
arteriellen Teil des Blutkreislaufes. Die Anzahl der in den
präkapillären Gefäßen festgehaltenen MS ist direkt proportional der
regionalen Organdurchblutung. Da die bisherige Markierung der MS
mit instabilen Nukliden die Nachteile des Umgangs mit
Radioaktivität mit sich brachte, hat man in den letzten Jahren
versucht, die MS mit Fluoreszenzfarbstoffen (FM) zu beladen. Diese
neue Art der Markierung erfordert allerdings, daß die FM
quantitativ aus den Organproben zurückgewonnen werden müssen. Dies
geschah bisher mittels Filtration oder Sedimentation. Beide
Methoden bieten jedoch Nachteile. Ziel unserer Studie war es, eine
neue Methode zu entwickeln und deren Verarbeitungsprozess zu
automatisieren. Dazu wurde ein Filtrationsgefäß entwickelt, das die
Probenverarbeitung (Gewichtsbestimmung, Verdauung, Filtration,
Spülung und Farbstoffauslösung) in einem einzigen Gefäß zuläßt und
hierbei die vollständige Rückgewinnung der FM aus der Organprobe
sicherstellt. Material und Methodik: Die von uns am Institut für
Chirurgische Forschung entwickelte Sample Processing Unit (SPU) –
gebrauchsmustergeschützt - besteht aus drei Untereinheiten:
Filterhalter, Filter und Probengefäß. Der essentielle Bestandteil
der SPU ist der Filter, der mit einem Polyamid-Filtergewebe
(Maschenöffnung 7µm) ausgestattet ist. Das von uns entwickelte
Verarbeitungsprotokoll sieht folgende Schritte vor: Die Gewebeprobe
wird in den Filter gelegt und das Probengewicht bestimmt. Der
Filter wird dann in ein Edelstahlkochgefäß gestellt und zur
Verdauung des Gewebes werden 15 ml Digestionsflüssigkeit (4N KOH
mit 0,02% Tween) und 1,5 ml Isopropanol 100% hinzugegeben. Nach 6
Stunden Inkubation bei 60°C ist das organische Material vollständig
aufgelöst und die FM schwimmen in der Zwischenschicht zwischen KOH
und Isopropanol. Mit Hilfe von Unterdruck wird die Flüssigkeit
durch das Filtergewebe filtriert. Dadurch kommen die FM auf der
Membran zu liegen. Der später von den FM ausgelöste
Fluoreszenzfarbstoff benötigt ein neutrales Umgebungsmilieu. Hierzu
müssen alle KOH-Rückstände aus dem Filter entfernt werden. Dies
geschieht mittels eines Phosphatpuffers (29.9g K2HPO4 in 800ml aqua
dest. vermischt mit 5.88g KH2PO4 in 200ml aqua dest.), der auf
einen neutralen pH-Wert eingestellt ist. Mit 15 ml dieses Puffers
wird die gesamte Innenfläche des Filters abgespült. Durch kurzes
Eintauchen des Filters in den Puffer wird auch die Außenfläche von
den KOH-Resten befreit. Nach Trocknung des Filters durch
Zentrifugation (4000 U/min für 4 min) wird der Farbstoff mit 2 ml
eines organischen Lösungsmittels (2-Ethoxyethyl acetat -
Cellosolve) aus den FM ausgelöst. Durch erneute Zentrifugation
(4000 U/min für 4 min) wird der Farbstoff im Sammelgefäß
aufgefangen und die Fluoreszenzintensität in einem
Fluoreszenzspektrometer (LS50B, Perkin Elmer, Überlingen,
Deutschland) bestimmt. Die Konzentration des Farbstoffes läßt auf
die Anzahl der FM rückschließen, welche wiederum direkt
proportional zum Blutfluß in der untersuchten Gewebeprobe ist. Der
Proportionalitätsfaktor wird durch eine Blutreferenzprobe bestimmt,
die während der Injektion der FM aus der Aorta thoracalis unter
konstanter Pumpenzuggeschwindigkeit (Harvard Pump, Harvard
Apparatus South Nattick, USA) entnommen wird. Diese Blutprobe kann
ohne vorherige Verdauung unter Koagulationsschutz (CPDA mit dem
Hauptbestandteil Citrat) direkt filtriert werden. Der Farbstoff
wird mittels Cellosolve aus den Mikrosphären ausgelöst und die
Fluoreszenzintesität bestimmt. Experimente Zunächst wurden die FM
und die SPU in vitro Tests unterzogen. Bei den FM wurde mit Hilfe
einer Verdünnungsreihe die Proportionalität zwischen der Anzahl der
FM und der Fluoreszenzintensität untersucht. Die SPU und die
dazugehörige Verarbeitungsmethode wurden einer Wiederfindungsstudie
unterzogen. Dabei wurde dieselbe Anzahl von FM aller Farben in
Filter und Glasröhrchen pipettiert. Die Filter durchliefen den
gesamten Verarbeitungsprozeß. Das Filtrat und die Wände der Filter
wurden auf die Präsenz von FM hin kontrolliert. Die
Farbstofflösung, welche aus den 40 Filtern gewonnen wurde, wurde
mit einer Referenzgruppe (Glasröhrchen ohne Probenverarbeitung,
n=20) verglichen. Zur in vivo Validierung der SPU erfolgten an
narkotisierten Schweinen (n=8) sechs simultane Injektionen von
radioaktiv markierten 15µm MS (RM) (Niob, Strontium, Scandium,
Indium, Cerium und Chrom) und 15µm FM (blue, bluegreen,
yellowgreen, orange, red, scarlet) zu verschiedenen Zeitpunkten.
Nach der Entnahme von Leber und Nieren, wurden diese Organe nach
einem vorgegebenen Schema disseziert. Der regionale Blutfluß wurde
anhand der Protokolle sowohl für RM (SCHOSSER et al. 1979) als auch
FM bestimmt. Zunächst wurde die Radioaktivität der Proben im
g-Counter (Canberra Packard, Frankfurt a.M., Deutschland)
ermittelt. Hierauf wurde nach Verarbeitung der Organgewebe in der
SPU die Fluoreszenzintensität mit Hilfe des
Fluoreszenzspektrometers gemessen. Der Vergleich mittels beider
Methoden erhobener Meßwerte wurde mit dem Bland-Altman-Plot
durchgeführt. Hierbei wird das arithmetische Mittel der Blutflüsse,
die durch FM- und RM-Methode berechnet worden sind, gegen die
prozentuale Abweichung der FM von den RM aufgetragen. Zur Kontrolle
der Filterfunktion und der Zuverläßigkeit der Meßergebnisse wurde
die gleiche Anzahl (ca. 2500 FM) einer nicht im Experiment
verwendeten 15 µm FM-Spezies (crimson), sowohl in SPU-Filter
(SPU-Gruppe, n = 60), als auch in 20 Glasgefäße (Referenzgruppe, n
= 20) gegeben. Die SPU wurden dem gesamten Protokoll der
Probenverarbeitung unterzogen, wohingegen in der Referenzgruppe
lediglich der Farbstoff ausgelöst und gemessen wurde. Die Gruppen
wurden mittels t-test nach Student, p0,98). Die
Filter weisen eine Wiederfindungsrate von 100% auf. Im Eluat fanden
sich keine 15µm FM; zwischen der Filtergruppe und der
Referenzgruppe besteht kein signifikanter Unterschied in der
Fluoreszenzintensität. Es zeigt sich eine sehr gute
Vergleichbarkeit beider Methoden. In den Bland-Altman Plots für die
Nieren- und Leberproben wichen die Blutflußwerte mit der FM-Methode
um 8,2 bis 13,4% vom mittleren Fluß (arithmetisches Mittel aus RM
und FM) ab. Dabei betrug die mittlere Differenz beider Methoden
zwischen -7,4% und 3,8%. Der Vergleich der mittleren Intensitäten
der Kontrollfarbe crimson zwischen der Referenzgruppe (9,32±0,74,
n=20) und der SPU- Gruppe (9,38±0,98, n=60) ergab keinen
signifikanten Unterschied. Diskussion und Schlußfolgerung Mit der
SPU ist es möglich, FM vollständig aus Organproben zurückzugewinnen
und dadurch den regionalen Blutfluß quantitativ zu bestimmen. Die
errechneten Blutflusswerte der radioaktiven und fluoreszierenden
Methoden sind miteinander vergleichbar. Somit stellen die FM eine
valide Alternative zu RM unter Vermeidung der Problematik des
Umgangs mit Radioaktivität dar. Der entscheidende Vorteil der SPU
ist, daß der gesamte Verarbeitungsprozeß im selben Gefäß
stattfindet, und so der Verlust von FM nahezu ausgeschlossen
ist.Das standardisierte Protokoll der Probenverarbeitung mittels
SPU vermindert im Vergleich zu früheren Protokollen die
Bearbeitungszeit von ca. 24h bzw. 48h auf ca. 6h und reduziert die
Arbeitsschritte bei denen große Präzision gefordert ist. Das Design
der SPU ermöglicht eine Automatisierung der Probenverarbeitung und
somit eine Arbeitserleichterung, da die Von-Hand-Bearbeitung nur
noch auf das Befüllen der SPU reduziert wird