Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06 Archiv

Komplexchemische Umsetzungen von Übergangsmetall(I)- und (II)-Komplexen mit symmetrischen Fluoreszenz-Farbstoffen vom DPP-Typ. Darstellung eines monoalkylierten unsymmetrischen DPP-Farbstoffs und dessen komplexchemischen Umsetzungen mit Gold(I)-Verbindungen. Synthese von Perylen-Komplexen aus dem Farbstoff S13NH und Gold(I)-, Palladium(II)- und Platin(II)-Komplexen.

Initiation of transcription by eukaryotic RNA polymerase II is finely controlled by a multitude of regulatory factors. Among them, the negative cofactor 2 (NC2), composed of the subunits NC2alpha and NC2beta, is able to bind directly to TBP-DNA complexes, preventing the assembly of the general transcription factors TFIIA and TFIIB. Despite extensive research on the negative and positive function of NC2, several questions concerning its regulation remain unexplored. In particular, localization and post-translational modifications are poorly understood. This work is the first to give some insights on the regulation of this factor. We present evidence that both subunits contain a nuclear localization signal (NLS) responsible for the accumulation of proteins in the nucleus. Immunofluorescence studies showed that NC2 dimer localizes exclusively in the nucleoplasm. However, the two subunits reveal characteristic and unique distribution patterns: NC2alpha is also found in the nucleoli, and NC2beta in small concentrations also in the cytoplasm. Moreover, we show that the two subunits already dimerize in the cytoplasm and are transported into the nucleus as a complex. Interestingly, both NLS are essential for import of the dimer. We also report for the first time several isoforms of both subunits. In vivo labeling experiments showed that NC2alpha is specifically hyperphosphorylated during mitosis. This modification does not impair its ability to dimerize with the partner and bind to TBP-DNA complexes, nor affects the stability of the complex. Furthermore, the phosphorylated protein maintains the ability to mobilize TBP on the DNA. These results suggest that NC2 is still bound to DNA during mitosis, in line with the idea that this factor keeps TBP stably associated to DNA.

Die Dissertation handelt von Umsetzungen von Organometall(I)-Verbindungen (Bsp. Mn(CO)5X, Re(CO)5X (X = Cl, Br, I) mit Aziridinen sowie C-Nitroso-Verbindungen. Alle synthetisierten Verbindungen wurden mit Methoden wie NMR, IR, UV-Vis Spektroskopie sowie mit Elementaranalysen charakterisiert. Außerdem wurde für ein Großteil der Verbindungen Röntgenstrukturanaylsen durchgeführt.

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des Einflusses verschiedener Naturstoffe auf die Expression und Aktivität des menschlichen eNOS Proteins in endothelialen Zellen. Zum einen wurde untersucht, ob die Sojaisoflavone Formononetin, Biochanin A, Genistein und Daidzein die Expression und Substartumsatz der eNOS erhöhen können. Zum anderen wurde die Wirkung einer großen Anzahl von Rotweinpolyphenolextrakten auf die eNOS Expression und Enzymaktivität untersucht. Damit sollte die Frage geklärt werden, ob Anbaugebiet, Rebsorte und Vinifikationsprozeß das Ausmaß der Steigerung von eNOS Expression und Aktivität durch Rotweinpolyphenolextrakte beeinflussen und ein Hinweis auf wirksamkeitsbastimmende Substanzen erhalten werden. Das Sojaisoflavon Genistein erhöht die eNOS Enzym Aktivität und die eNOS vermittelte NO Produktion nach 48-96 h Stimulation. Diese Effekte sind durch den Estrogen Rezeptor Antagonisten ICI 182,780 nicht hemmbar. Durch den Vergleich einer großen Anzahl Rotweinpolyphenolextrakte aus verschiedenen Rotweinen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß Rebsorte und Anbaugebiet einen Einfluß auf das Ausmaß der Wirkung von Rotwein auf die Expression des eNOS Gens haben. Weißweinpolyphenolextrakte steigern in vergleichbarem Maß die Aktivität des eNOS Promotors. Aus der unterschiedlichen Zusammensatzung von wirksamen und weniger wirksamen Rotweinpolyphenolextrakten und Weißweinpolyphenolextrakten könnten künftig Rückschlüsse auf die wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffe gezogen werden. Bereits in den Trauben liegen Substanzen vor, die die eNOS Expression verstärken. Der Vinifikationsprozeß scheint die Aktivität jedoch weiter zu steigern. Für den Rotweininhaltsstoff Resveratrol konnte ein Effekt auf die eNOS Expression nachgewiesen werden. Resveratrol steigerte die eNOS Expression jedoch erst in höheren Konzentrationen, als bei der Stimulation endothelialer Zellen mit RWPE erreicht werden konnten. Resveratrol scheidet somit als alleiniger Stimulus der eNOS Expression aus. Zusammen mit anderen Inhaltstoffen kann es aber möglicherweise essentiell zum Gesamteffekt beitragen. Mit dem Beginn der Evaluierung von Einsatzmöglichkeiten der CARS Mikroskopie zur Detektion biologisch interessanter Moleküle, insbesondere von NO, in lebenden Zellen wurde ein grundlegender Beitrag zur Erweiterung der Methodenpalette innerhalb der biomedizinischen Forschung geleistet.

Humanpathogene Yersinien nutzen ein Typ III-Sekretionssystem (TTSS), um Virulenzproteine in die Wirtzelle zu injizieren und so der angeborenen Immunantwort des Wirts zu entkommen. Die homologen Proteine YscM1 und YscM2 in Yersinia enterocolitica gelten als funktionell austauschbare negative Regulatoren des TTSS. Ziel dieser Arbeit war die nähere Charakterisie-rung der Funktion von YscM1 und YscM2. Mithilfe von Wechselwirkungsstudien wurde in Y. enterocolitica ein Interaktionspartner der beiden Proteine gefunden, der durch Mas-senspektrometrie als Phosphoenolpyruvatcarboxylase (PEPC) identifiziert wurde. Bei der PEPC handelt es sich um ein Stoffwechselenzym, das die Synthese von Oxalacetat aus Phosphoenol-pyruvat und CO2 katalysiert und somit der Aufrechterhaltung des Citratzyklus dient, da dieser neben der Energiegewinnung auch Bausteine für Aminosäuresynthesen liefert. YscM1 und YscM2 sowie deren Chaperon SycH und PEPC wurden rekombinant hergestellt und gereinigt. Mit den gereinigten Proteinen konnte die Bindung von PEPC an YscM1 und YscM2 bestätigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass beide Proteine antagonistisch wirken. YscM1 drosselt die Enzymaktivität von PEPC, während YscM2 die Aktivität erhöht. Um einen Effekt von YscM1 und YscM2 auf die Enzymaktivität von PEPC in vivo zu untersuchen, wur-den beide Proteine in Y. enterocolitica überexprimiert. Die Wachstumsbedingungen wurden dabei so gewählt, dass die Yersinien auf die PEPC-Reaktion angewiesen waren. Bei Überpro-duktion von YscM1 kam das Wachstum der Yersinien dabei völlig zum Erliegen, während YscM2 das Wachstum stimulierte. Die hier beschriebene Funktion von YscM1 und YscM2 ließ sich als völlig neue Funktion gegenüber der bekannten regulatorischen Funktion abgrenzen. Mausinfektionsversuche zeigten für eine ppc- und eine yscM1-Mutante einen attenuierten Phä-notyp, während die yscM2-Mutante keine Unterschiede in der Pathogenität im Vergleich zum Wildtyp aufwies. Für pathogene Bakterien ist vielfach beschrieben, dass sich deren Stoffwechsel auf die Expres-sion von Virulenzfaktoren auswirkt. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass ein Virulenzfaktor den Stoffwechsel eines bakteriellen Erregers moduliert. Vermutlich ist durch die Modulation der Enzymaktivität eine optimale Anpassung an die Ernährungssituation im Wirt möglich, da eine Balance zwischen Energiestoffwechsel und der Synthese von Viru-lenzfaktoren sichergestellt wird. Da die PEPC im Menschen nicht vorkommt, aber für viele pathogene Bakterien von großer Bedeutung sein dürfte, könnte die PEPC ein interessantes Angriffsziel für Antibiotika und die Wechselwirkung zwischen YscM1 und PEPC die Grundlage für deren Entwicklung darstellen.

For the development of improved polyethylenimine (PEI) polyplexes towards ‘artificial viruses’ two key issues are i) to improve the toxicity profile of the applied vectors and ii) to enhance endosomal release, one of the major barriers to efficient gene transfer with PEI polyplexes. Nonviral vectors based on PEI usually contain an excess of PEI that is not complexed to DNA. Since free PEI contributes to cellular and systemic toxicity purification of polyplexes from unbound PEI is highly desirable. In this thesis an easy and efficient method based on size exclusion chromatography (SEC) was developed, which for the first time allowed complete removal of PEI from PEI polyplexes. Moreover, purification of polyplexes enabled to clarify the role of free PEI in gene delivery at the cellular level. Most importantly, the removal of unbound PEI significantly reduced toxicity of the applied polyplexes. However, purified polyplexes without free PEI were less efficient in transfection compared to non-purified polyplexes. Mechanistic studies showed that free PEI most likely enhanced endosomal release of polyplexes and therefore contributed to efficient gene transfer with PEI polyplexes. Nevertheless, the availability of a defined, well-tolerated gene transfer formulation is a vital precondition for the further development of nonviral gene therapeutics, and a purification method like the one developed in this thesis will help to fulfill these requirements. To enhance endosomal release of PEI polyplexes, the membrane active peptide melittin was incorporated into the vector particles. It has been shown previously that PEI bound to the N-terminus of natural all-(L)-melittin (all-(L)-N-mel-PEI) enhanced gene delivery with PEI polyplexes. Here, it was demonstrated that transfection efficiency of N-mel-PEI is independent of the enantiomeric configuration of the bound peptide which allowed the use of non-immunogenic all-(D)-melittin for the generation of optimized melittin-PEI conjugates. To determine the optimal site of melittin-linkage to PEI, the polycation PEI was covalently attached to the N-terminus (N-mel-PEI) or the C-terminus of melittin (C-mel-PEI) in all-(D)-configuration. The site of melittin-linkage had a strong impact on the membrane destabilizing activities of the resulting melittin-PEI conjugates. C-mel-PEI was highly lytic at neutral pH and therefore elevated doses of C-mel-PEI polyplexes induced high toxicity. In contrast, N-mel-PEI was less lytic at neutral pH but retained higher lytic activity than C-mel-PEI at endosomal pH 5. This apparently promoted better endosomal release of N-mel-PEI polyplexes resulting in efficient gene delivery in different cell lines. The high potency of C-mel-PEI to destabilize membranes at neutral pH is presumably due to a reported destabilization mechanism proceeding through membrane insertion of the peptide. In contrast, N-mel-PEI is supposed to induce lysis by insertion-independent pore formation according to the toroidal pore model. Since membrane destabilization by membrane insertion requires lower peptide to lipid ratios than destabilization by pore formation, C-mel-PEI was considered as the more potent template to generate improved endosomolytic melittin-PEI conjugates. The new melittin-PEI conjugates should display pronounced lytic activities at endosomal pH 5. Therefore, PEI was attached to the C-terminus of melittin analogs which were modified with acidic residues. The conjugates with the highest lytic activities at endosomal pH 5 were indeed the most efficient in transfection. This apparent correlation of gene transfer efficiency with lytic activity at pH 5 was in excellent agreement with results obtained with unmodified melittin-PEI conjugates and other membrane-active peptides used in gene transfer. The most efficient melittin-PEI conjugates were incorporated into surface-shielded and receptor-targeted PEI polyplexes, and the resulting particles were further purified by SEC to remove unbound toxic polycations. Endosomolytic melittin-PEI conjugates stably incorporated into such purified polyplexes significantly enhanced transfection efficiency in comparison to polyplexes lacking melittin. Most importantly, these polyplexes exposed an improved toxicity profile providing an artificial virus-like vector that is efficient and safe also for potential in vivo administration.

Proteine leisten den entscheidenden Beitrag zur Struktur und Funktion der Zellen aller Lebewesen.Vieles spricht daher für eine Betrachtung des Proteoms oder einer Teilmenge davon (Subproteom), um den Zustand lebender Zellen zu beschreiben. Mit optimierten und neuen Methoden wurde das regulatorische Netzwerk, welches auf der Ebene der Trankription die Expression von Proteinen entscheidend mitbestimmt, genauer betrachtet. Hierzu wurden Zellfraktionierungsprotokolle optimiert, um die Proteine des Zellkerns und des Chromatins anzureichern und in nachfolgenden Analysen verwenden zu können. Es wurden Antikörper gegen verbreitete, funktional relevante Peptidmotive generiert. Aufbauend auf dem Konzept der Motivantikörper wurde eine Färbemethode für Zellkernproteine mit Kernlokalisationssignal entwickelt. Schließlich wurde mit den Methoden der Zellfraktionierung und spezifischeren Antikörpertechniken eine Analyse des humanen Mediator-Komplexes der RNA Polymerase II unternommen, die zur Entdeckung neuer Untereinheiten, potentiell interagierender Proteine und Phosphorylierungen im Komplex führte.

Die Biogenese von Mitochondrien erfordert den Import von Präproteinen aus dem Cytosol in die mitochondrialen Subkompartimente. Der TIM23-Komplex der mitochondrialen Innenmembran ist für die Translokation von Präproteinen über die Innenmembran verantwortlich und vermittelt darüber hinaus die Insertion von Proteinen in die Innenmembran. Tim23 weist zwei funktionell unterscheidbare Domänen auf: Eine N-terminale hydrophile Rezeptordomäne im Intermembranraum und einen hydrophoben C-terminalen Bereich. Das phylogenetisch verwandte Tim17 ist ein sehr hydrophobes Protein, welches vier Transmembrandomänen ausbildet, die von zwei kurzen Enden im Intermembranraum flankiert werden. Die hydrophoben Bereiche von Tim17 und Tim23 bilden vermutlich den kanalbildenden Teil der Translokase. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von Tim17 bei der Translokation von Präproteinen über die Innenmembran untersucht. Es konnte eine kurze N-terminale Sequenz von 11 Aminosäureresten identifiziert werden, welche für die Funktionalität der TIM23-Translokase essentiell ist. Die Deletion dieser Sequenz beeinflusst die Integrität der bekannten Untereinheiten der TIM23-Translokase nicht, führt jedoch zu einer starken Beeinträchtigung der Translokation von Präproteinen über die mitochondriale Innenmembran. Durch gezielte Alanin-Punktmutagenese konnten zwei konservierte Aspartatreste in der Tim17-Sequenz identifiziert werden, welche für den Translokationsdefekt verantwortlich sind. Die Analyse weiterer Mutanten in Tim17 mit einzelnen oder wechselseitig ausgetauschten geladenen Aminosäureresten im Intermembranraum legen nahe, dass die konservierten negativen Ladungen in Tim17 mit den positiv geladenen Präsequenzen interagieren und dadurch die Translokation von Präproteinen durch den TIM23-Komplex regulieren. Diese Ergebnisse geben einen Einblick in eine Präprotein-abhängige Regulation der TIM23-Translokase über ein mögliches "Öffnen" und "Schließen" des Translokationskanals via Tim17. Die meisten Proteine der mitochondrialen Innenmembran, die als Präproteine mit mitochondrialen Präsequenzen im Cytosol synthetisiert werden, erreichen die Innenmembran auf einem von zwei alternativen Sortierungswegen: Dem "Stop-Transfer-Weg", auf dem Präproteine während der Translokation durch den TIM23-Komplex arretiert und lateral in die Innenmembran inseriert werden und dem Weg der "Konservativen Sortierung", auf dem die Proteine über Intermediate in der mitochondrialen Matrix in die Innenmembran inseriert werden. Folglich müssen diese Proteine entsprechende Sortierungssignale aufweisen, die entweder die laterale Membraninsertion (Stop-Transfer-Proteine) oder die die Translokation in die Matrix (konservativ sortierte Proteine) durch die TIM23-Translokase vermitteln. Das Sortierungsverhalten von mitochondrialen Innenmembranproteinen mit N-terminalen Präsequenzen, die zunächst für die initiale Translokation des N-Terminus der Proteine sorgen, wird von den Transmembrandomänen bestimmt. Um den Einfluss der Transmembrandomänen auf den Sortierungsweg zu untersuchen, wurden die entsprechenden Domänen von Stop-Transfer sortierten Proteinen und konservativ sortierten Proteinen wechselseitig ausgetauscht. In den chimären Proteinen bestimmten jeweils die eingeführten Transmembrandomänen das Sortierungsverhalten. Eine Untersuchung dieser Transmembrandomänen zeigte zwei systematische Unterschiede: Transmembrandomänen, die die konservative Sortierung vermitteln, weisen eine zumeist moderate Hydrophobizität auf und enthalten zumeist Prolinreste. Dagegen sind Stop-Transfer vermittelnde Transmembrandomänen typischerweise stärker hydrophob und frei von Prolinresten. Die Einführung von Prolinresten in die Transmembrandomänen von ursprünglich Stop-Transfer sortierten Proteinen führte zu deren Translokation in die Matrix. Umgekehrt führte die Mutagenese von Prolinresten in Transmembrandomänen ursprünglich konservativ sortierter Proteine zu deren Arretierung in der Innenmembran. Die Anwesenheit von Prolinresten in den Transmembrandomänen bestimmt demnach den Sortierungsweg dieser Innenmembranproteine. Zukünftige Studien werden zeigen, wie diese Sortierungssignale, welche eventuell eine von Prolinresten gebrochene hydrophobe Helix darstellen, von der TIM23-Translokase erkannt und entsprechend umgesetzt werden. Die Bedeutung von Prolinresten in Transmembrandomänen von konservativ sortierten Proteinen konnte durch Mutagenese sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt werden. Diese Erkenntnis sollte sowohl in Vorhersagen von Proteinsortierungswegen als auch bei der zukünftigen Entwicklung mitochondrialer Proteine für gentherapeutische Ansätze zur Behandlung mitochondrialer Erkrankungen berücksichtigt werden.

Gradual depletion of the ozone layer and consequently, increased ultraviolet (UV) radiation on the Earth's surface induces DNA-lesions inside the genome, thereby causing mutations. Three kinds of photoproducts are mainly formed, namely: cyclobutane pyrimidine dimers (CPD), pyrimidine-(6-4)-pyrimidone dimer [(6-4)PP] and the Dewar valence isomer of (6-4)PP lesion. The formation of these photolesions is a major cause of cell death (aging) and fatal disease like skin cancer. A part of this research was performed to investigate the formation and characterization of DNA-lesions under UVC radiation. Small, fluorescent labeled oligonucleotide hairpins (DNA, RNA and mixed DNA-RNA) were employed to this purpose. The amount of damage was quantified using HPLC. Here, a new method was developed, using ion-exchange SAX-column which works at pH = 13, to measure the lesion formation in a direct way. In order to know which lesions are formed, the irradiated hairpins were enzymatically digested. The lesions were separated by HPLC followed by their characterization using MS/MS fragmentation analysis. Investigation was performed to understand the impact of the neighboring nucleobases on the photo-reactivity of a dTpdT-dinucleotide. For this, hairpins were prepared in various sequential contexts. Analysis of these irradiated hairpins revealed the surprising result that the reactivity is strongly reduced when a dTpdT dinucleotide is locked between two neighboring 2'- deoxyguanosines, strongly implying that genomic DNA will be inhomogeneously damaged and hence mutated under UVC radiation. In order to account for the effect of oligonucleotide conformations (A versus B) on the photolesions formation, DNA, RNA and mixed DNA-RNA hairpins were irradiated. The most surprising observation is that the oligonucleotide hairpins, possessing more A-like conformations were found to be very much resistant to UVC degradation. RNA hairpins containing UpU dinucleotides were found to be fully protected from being damaged. A short, dTpdT-containing DNA stretch, embedded in an A-like RNA environment, was also found to be highly stable under UVC light. In the second part of this study, investigation was performed to assay the activities of CPD-photolyase enzyme isolated from different organisms. A synthetic cis-syn thymidine dimer with an open backbone was incorporated into DNA. CPD-photolyases were found to recognize and split this CPDlesion, via a cycloreversion process, into two 2'-deoxythymidine monomers. In order to profile the activities of photolyases and also to study photolyase activity inside living cell, a sensitive DNA-probe, known as molecular beacon was synthesized. The hairpin probe, which features a loop and stem structure contains the model CPD-lesion in its loop region. The molecular beacon (MB 1) in its closed form, is non-fluorescent due to efficient energy transfer (FRET) from the 5'-FAM to 3'-Dabsyl. The MB 1 was designed to undergo strand break on reaction with photolyase in presence of light, thus separating the FAM and the Dabsyl and causing the fluorescence of FAM to be restored. The activities of the photolyase can be studied by monitoring the fluorescence change. Activities of CPDphotolyase isolated from A. nidulans and A. thaliana were studied using this MBprobe. The sensitivity of this probe was tested with wild-type cell-extract from A. thaliana. The fishing-out of photolyase activity from this wild-type extract was possible. Effort was made to investigate the repair process within a living cell, using laser scanning fluorescence microscopy. The insertion of this artificial, chemically modified DNA-substrate in the cell nucleus was achieved.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die katalysierte Aminolysereaktion aktivierter Ester durch Amine in unpolaren Lösemitteln untersucht. Als Modelreaktion diente dabei die n-Butylaminolyse von p-Nitrophenylacetat, die mit Hilfe von 1H-NMR-Messungen in CDCl3 spektroskopisch verfolgt wurde. Als Katalysatoren dienten alkylsubstituierte 3-Cyano-2-pyridone. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde in Abhängigkeit von den Konzentrationen aller Komponenten untersucht. Die angenommenen Geschwindigkeitsgesetze konnten so bestätigt werden. Der Aufbau von Dipeptiden durch eine Aminolysereaktion wurde ebenfalls untersucht. Als Esterkomponente wurden stickstoffgeschützte Aminosäurephenylester und Aminosäure-p-nitrophenylester mit Aminosäureethylester als Aminkomponente umgesetzt. Auch diese Aminolysereaktionen werden durch 2-Pyridone beschleunigt. Durch die Synthese eines chiralen 2-Pyridons konnte der Einfluss auf chirale Aminosäurederivate beobachtet werden. Für eine kinetische Racematspaltung war der beobachtete Effekt aber zu gering. Bei quantenchemische Rechnungen zur Tautomerisierung von 2-Pyridon zu 2-Hydroxypyridin konnte festgestellt werden, dass beide Tautomere etwa gleich stabil sind. Auch die Dimerisierungsenergien von ca. 90 kJ/mol für das 2-Pyridon wurde durch quantenchemische Methoden bestimmt.

The work is introduced by reviews of wound healing and protein delivery using hydrogel carriers. In the following, the formulation studies of alpha1-Antichymotrypsin (ACT) are outlined starting with solution carriers. The latter are followed by formulation studies in hydrogels and dry gel forms, i.e. xerogels prepared by freeze-drying and films gained from air drying of hydrogels. All carriers are investigated upon their stabilizing activity on the protein drug also for mid term shelf life, their suitability for the use as wound dressings mainly from mechanical point of view, and their release behaviour especially for ACT. As a result, xerogel and film formulations are presented that match all requirements for such a product.