Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 14/19 Archiv

Formin proteins are actin nucleators and elongators which can be found in most eukaryotic cells. In this work, structure-function relationships between yeast formin Bni1p and actin polymerization were studied. In the first part of this work, it was attempted to clone and express formin constructs derived from yeast Bni1p (Saccharomyces cerevisiae), including the key FH2 domain and a modified FH1 domain. Biomathematical models involving both diffusion and concentration-limited actin recruitment kinetics could be tested with such proteins. Cloning was mostly successful, but only the FH2 domain alone was expressed. In the second part of this work, a salt effect on FH2 mediated actin nucleation was discovered by means of pyrene assays and epifluorescence microscopy. Potassium chloride (KCl) is a downregulator of FH2 nucleation activity: a higher KCl concentration leads to a significantly lower actin polymerization speed (kp, m), to a bigger lag time (tlag) and to a bigger t1/2, with the respective actin filament length distributions. The salt effect was shown to be significant in a KCl concentration range from 10 mM to 90 mM at two different FH2 concentration, but not in absence of FH2. The critical KCl concentration is lowered in the presence of FH2. Some initial experiments with sodium chloride point to a non-specific nature of this salt. This is in agreement with the electrostatic nature of the salt effect, which was studied further by computational means: A decrease of the KCl concentration leads to lower binding free energies of the protein-protein interactions in the crystallographically characterized actin-FH2 complex 1Y64. This is especially the case for the electrostatic Coulomb interaction of a specific area ("lasso" site). ANCHOR calculation results of solvent accessible surface areas (SASAs) corroborate the importance of this site. The experimentally found downregulation of FH2 mediated actin nucleation by KCl can therefore be explained by reduced actin recruitment by the FH2 dimer: KCl diminishes the surface charge of FH2 and actin and thus weakens electrostatic Coulomb interactions. In future, this newly discovered salt effect should be considered in experiments on formins, for example when performing in vitro screens for FH2 inhibitors. The relevance of this new salt effect in vivo remains to be demonstrated.

Morbus Fabry wird X-chromosomal vererbt und führt durch einen Defekt des lysosomalen Enzyms α-Galaktosidase A zu einer Störung im Glykosphingolipid-Katabolismus. Neutrale Glykosphingolipide, v.a. Gb3 (Globotriaosylceramid), akkumulieren in Lysosomen verschiedenster Gewebe. Mit zunehmender Ablagerung dieser Stoffe im Gefäßendothel und in den Organen kommt es zur Ausprägung der Krankheitssymptome. In der Kindheit beginnt die Erkrankung häufig mit Akroparästhesien und Angiokeratomen. Im weiteren Verlauf treten dann die lebenslimitierenden Manifestationen dieser Erkrankung auf, wie terminale Niereninsuffizienz und, durch Ischämie- und Infarktereignisse, Myokardinfarkt und zerebrale Ischämie. Im Gegensatz zur überwiegenden Mehrzahl anderer X-gebundener Erkrankungen zeigen bei Morbus Fabry nahezu alle heterozygoten Mutationsträgerinnen im Laufe der Zeit klinische Manifestationen dieser Erkrankung, teils in gleich schwerer Form wie männliche Patienten. Da bisherige Hypothesen davon ausgingen, dass eine Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten des mutierten GLA-Allels am Auftreten von Symptomen bei heterozygoten Fabry-Mutationsträgerinnen beteiligt sei, wurden die X-Inaktivierungsmuster von durch Mutationsanalyse gesicherten Morbus Fabry-Patientinnen mit Hilfe des Androgenrezeptor-Tests untersucht. Bei diesem Assay wird genomische DNA mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen inkubiert. Diese verdauen nur die unmethylierte DNA des aktiven X-Chromosoms, so dass in der anschließenden PCR-Amplifikation eines hochpolymorphen CAG-Repeats im Exon 1 des Androgenrezeptor-Gens lediglich Allele des inaktiven X-Chromosoms amplifiziert werden. Nach der automatisierten Auswertung mittels Fragmentanalyse, ermöglicht durch einen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten PCR-Primer, zeigt das Verhältnis der zwei Androgenrezeptor-Allele zueinander die relative Häufigkeit eines jeden Allels auf dem aktiven oder inaktiven X-Chromosom in den Zellen des untersuchten Materials. Erstmals wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit die X-Inaktivierungsmuster heterozygoter Mutationsträgerinnen von Morbus Fabry im Vergleich zu einem nichtverwandten Kontrollkollektiv untersucht. 13 (46%) der 28 Fabry-Mutationsträgerinnen zeigten eine random X-Inaktivierung, 10 (36%) eine moderate Verschiebung der X-Inaktivierung und 5 (18%) eine ausgeprägte Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten eines Allels. Es zeigte sich kein statistisch signifikanter Unterschied zu den Inaktivierungsmustern gleichaltriger Kontrollen (p = 0,669). Segregationsanalysen konnten anhand der Familien von sechs Frauen mit ausgeprägter oder moderater Verschiebung der X-Inaktivierung durchgeführt werden. Hier zeigte sich bei vier dieser Frauen eine Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten des Wildtyp GLA-Allels, während bei zwei weiteren eine Verschiebung zugunsten des mutierten Allels in Leukozyten erkennbar war. Bei jeder der Fabry-Patientinnen war sowohl der klinische Schweregrad der Erkrankung mittels MSSI (Mainz Severity Score Index), einem detaillierten Scoring-System für Morbus Fabry, als auch die Enzymaktivität der α-Galaktosidase A bestimmt worden. Eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der X-Inaktivierung in Leukozyten heterozygoter Fabry-Mutationsträgerinnen und deren klinischen oder biochemischen Krankheitsparametern konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass heterozygote Fabry-Patientinnen random X-Inaktivierungsmuster ähnlich denen gesunder Frauen aufweisen. Anhand unserer Daten konnte nicht belegt werden, dass das Auftreten und der Schweregrad der Erkrankung bei der Mehrzahl der heterozygoten Fabry-Patientinnen auf eine Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten des mutierten Allels als Pathomechanismus zurückzuführen ist. X-Inaktivierungsstudien können jedoch dazu beitragen, jene Frauen frühzeitig herauszufiltern, welche aufgrund einer bei ihnen möglicherweise rascher progredient verlaufenden Erkrankung von einer sehr teuren Enzymersatztherapie am meisten profitieren könnten.

The modern debate about schizophrenia began over 100 years ago, with Kraepelin’s description of “dementia praecox”. Despite this, central aspects of the disease remain mysterious and the disease itself is still associated with a high probability of an enduring limitation of the patient’s quality of life. While several conceptions of schizophrenia exist and are still under discussion, at least a provisional consensus regarding a valid measure of schizophrenia seems to have been reached: The Positive and Negative Syndrome Scale (PANSS) quantifies the current state of a person with schizophrenia by combining 30 different schizophrenia-associated symptoms into a single scale value. Even though the scale is widely used and is the measure of choice in many clinical trials, its psychometric properties are still the reason for serious confusion. In many research papers, one important fact about the PANSS is overlooked: it is an interval scale and, therefore, straightforward calculations of proportions are not appropriate. In other words, calculating simple percentage changes is incorrect and a prior scale correction is required. These kinds of calculations often appear in conjunction with responder analyses, as the definition of response is usually based on a predefined cut-off in terms of percent scale change. Two of the presented papers of this thesis are dealing with this urgent problem: using real data as well as simulated data sets, it is shown that ignoring the scale level of the PANSS can, in many cases, even lead to false test decisions concerning an examined treatment effect. Furthermore, an analysis of the problem’s urgency with regard to academic discussions, performed by way of a systematic study of literature in the highest-ranked journals dealing with schizophrenia, showed that incorrect calculations are widespread in the literature and that there is a strong need for a general clarification. As incorrectly calculated percent changes might be a reason for the published low cut-offs of response, as e.g. 20% or 30% cut-offs, the third included article in this thesis analyzes the association of correctly calculated percent changes in the PANSS with a generally measured therapy response. An equipercentile linking of percent PANSS changes and the improvement item of the Clinical Global Impression Scale (CGI) confirmed the choice of a considerably higher response cut-off of 50%. The combined conclusion of the three included articles is the emphasis on the need for a general methodological consensus in schizophrenia research. Valid and replicable research is only possible on the basis of generally accepted methods that rely on the correct application of scale theory in these studies.

The pathomechanisms of the progression of chronic kidney diseases involve progressive glomerulosclerosis with renal parenchymal cell loss by proapoptotic factors. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) is a proapoptotic cytokine that is produced by macrophages as well as by a variety of cell types. TNF-α signaling regulates cell survival and death. Like in other inflammatory renal diseases, the increased intrarenal TNF-α expression contributes to the disease progression of Alport nephropathy, “a non-inflammatory” murine CKD model. I show that TNF-α expressed by podocytes as well as by infiltrating leukocytes progressively activates renal parenchymal cells, inducing apoptotic pathways that can trigger glomerulosclerosis in Alport disease. The blockade of TNF-α by etanercept prolonged mean survival of Col4a3-deficient mice. The beneficial effect on life span was associated with a significant improvement of the glomerulosclerosis, proteinuria, and the glomerular filtration rate (GFR). In particular, etanercept treatment significantly increased the number of glomerular podocytes (WT-1 and nephrin co-staining) and the renal mRNA expression of nephrin and podocin without affecting markers of renal inflammation. The increased number of podocytes was consistent with less TUNEL-positive podocytes that undergo apoptosis. Importantly, exogenous signals, e.g. infections or toxins, have the potential to regulate the influx of immune cells including dendritic cells, macrophages, neutrophils, and T cells. Here I report a large influx of leukocyte subsets that are mostly dendritic cells and macrophages in Col4a3-deficient mice as compared to wildtype mice. While bacterial endotoxin treatment had no effect on the renal disease progression, bacterial cytosine-guanine (CpG)-DNA exacerbated all aspects of Alport nephropathy and reduced the overall life span of Col4a3-deficient mice. This effect of CpG-DNA was associated with a significant increase of renal CD11b+/Ly6Chigh macrophages, intrarenal production of TNF-α, iNOS, IL-12, and CXCL10. CpG-DNA switched intrarenal macrophages from non-activated phenotype (M2) towards the classically activated form (M1). These M1 macrophages increased the secretion of TNF-α, which accelerated the disease progression of Alport nephropathy by inducing podocyte loss. Taken together, I demonstrated that TNF-α is a crucial cytokine which induces podocyte loss in the natural course of the progression of Alport nephropathy. Moreover, the expression of TNF-α is enhanced by selective exogenous factors, e.g. TLR9 activation, which alter the phenotype of renal macrophages towards the M1 phenotype. TNF-α blockade might therefore represent a novel therapeutical option to delay the progression of Alport nephropathy and potentially of other forms of glomerulosclerosis in non-inflammatory and inflammatory conditions.

Der häufigste neuronale Verbindungstyp im Riechkolben (Bulbus olfactorius) der Säuger ist die reziproke dendrodendritische Synapse zwischen den glutamatergen Mitralzellen (den Prinzipalneuronen des Bulbus) und den GABAergen Körnerzellen. Die dendritische Kalziumdynamik der axonlosen Körnerzellen ist aufgrund ihrer dendritischen Freisetzung von besonderem Interesse und zeichnet sich durch einen ungewöhnlich langsamen Verlauf aus. Zwei mögliche Ursachen dafür stehen im Zentrum dieser Dissertation: (1) Der unspezifische Kationenstrom ICAN, der in Körnerzellen nach synaptisch evozierten Aktionspotenzialen beobachtet wird, und (2) die endogene Kalziumdynamik der Körnerzellen. Diese Phänomene wurden mittels Zwei-Photonen-Laser-Scan-Mikroskopie und simultaner Einzelzellableitung in akuten Hirnschnitten von adulten Mäusen untersucht. In dieser Arbeit wurde die molekulare Identität von ICAN als Kombination aus TRPC1 und TRPC4 (transient receptor potential classic) vermittels Tieren mit Deletionen der entsprechenden Gene aufgeklärt (Kollaboration mit Prof. Marc Freichel, Homburg). Im Vergleich zum Wildtyp fehlten in der TRPC1/4 Doppeldeletion ICAN und der assoziierte langsame Ca2+-Einstrom. Damit wurde erstmals eine synaptische Funktion von TRPC-Kanälen im Bulbus nachgewiesen. Weiterhin wurde ein bislang unbekannter Aktivierungsweg von TRPC-Kanälen entdeckt, nämlich über NMDA-Rezeptoren. Bezüglich der endogenen Kalziumdynamik wurde festgestellt, dass nicht etwa eine große Pufferkapazität dem langsamen Abbau von Ca2+-Signalen zugrunde liegt, sondern vielmehr eine geringe Extrusionsrate. Damit sind beide Mechanismen – TRPC-Kanäle und endogene Kalziumdynamik – für den langsamen Verlauf von Ca2+-Transienten in Körnerzellen mitverantwortlich.

Die von intrinsichen renalen Zellen und infiltrierenden Leukozyten exprimierten Zytokine sind zentrale Vermittler entzündlicher Nierenerkrankungen. Tumor Nekrose Faktor-α (TNF) ist ein solches proinflamatorisches Zytokin, das in der glomerulären Entzündungsreaktion involviert ist. Die funktionelle Rolle von TNF wurde in Tiermodellen der Glomerulonephritis belegt. Die biologischen Effekte von TNF werden durch die beiden funktionell eigenständigen TNF-Rezeptoren TNFR1 (CD120a) und TNFR2 (CD120b) vermittelt. Neuere Daten zeigen, dass in Modellen einer Immunkomplex-Glomerulonephritis wie der nephrotoxische Serumnephritis die beiden TNF-Rezeptoren in vivo unterschiedliche Funktionen bei der glomerulären Entzündung vermitteln können. Der vorliegenden Arbeit liegt die Hypothese zugrunde, dass Tnfr1 und Tnfr2 unterschiedliche inflammatorische TNF-Effekte in Glomeruli vermitteln. Daher war das Ziel dieser Arbeit, Expression und Funktion der beiden TNF-Rezeptoren in Maus-Glomeruli zu charakterisieren und die Tnfr-abhängig exprimierten Entzündungsmediatoren in Maus-Glomeruli zu identifizieren. Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit könnten selektive, Tnfr-spezifische Therapien zur Hemmung der glomerulären Entzündungsreaktion entwickelt werden. Zudem wurde in dieser Arbeit die funktionelle Rolle der beiden TNF-Rezeptoren im MRL/lpr-Mausmodell der Lupusnephritis untersucht, um eine selektive Tnfr-Blockade als mögliche Therapiestrategie zu charakterisieren. Hierfür war eine Rückkreuzung von Tnfr1- und Tnfr2-defizienten C57BL/6J-Mäusen in den MRL/lpr-Hintergrund erforderlich. Um TNF-Rezeptor-1- und 2-vermittelte inflammatorische Signalwege in Glomeruli zu identifizieren wurde die Expression und die Funktion der beiden TNF-Rezeptoren in Mausnieren, in isolierten Glomeruli ex vivo und murinen glomerulären Endothel- und Mesangialzellen in vitro untersucht. In normaler Mausniere konnte eine Tnfr1- und Tnfr2-mRNA- und Protein-Expressionen präferentiell in Glomeruli im Vergleich zum Tubulointerstitium nachgewiesen werden. Die Expression von beiden TNF-Rezeptoren und die TNF-induzierte Induktion von Tnfr2-mRNA-Expression wurde auch in vitro sowohl in murinen glomerulären Endothel- als auch Mesangialzelllinien bestätigt. Die prominente glomeruläre TNF-Rezeptor-Expression korrelierte mit einer konstitutiven glomerulären mRNA-Expression von Adhäsionsmolekülen wie Icam-1, Vcam-1, E- und P-Selektin und Chemokinen wie Ccl2, Ccl3 und Ccl5. Eine intraperitoneale TNF-Injektion induzierte die Expression dieser Mediatoren präferentiell in Glomeruli. Diese in vivo TNF-Exposition führte zu einer raschen glomerulären Akkumulation von Leukozyten einschließlich Neutrophilen und mononukleären Phagozyten, die mittels einer kompartimentspezifischer Durchflußzytometrie analysiert wurden. Um Tnfr-abhängige inflammatorische Effekte in intrinsischen glomerulären Zellen unabhängig von infiltrierenden Leukozyten zu untersuchen, wurde eine Microarray-Gene-Expressionsanalyse an intakten Glomeruli durchgeführt, die aus Wildtyp und Tnfr-defizienten Mäusen isoliert und anschließend mit TNF ex vivo stimuliert wurden. Die meisten TNF-Effekte wurden ausschließlich durch Tnfr1 vermittelt, unter anderem die induzierte mRNA-Expression von Adhäsionsmolekülen, proinflammatorischen Chemokinen, Komplement-Faktoren und proapoptotischen Molekülen. Im Gegensatz dazu fanden wir nur vier Tnfr2-abhängig exprimierte Gene, einschließlich einer kleinen GTPase der Rab-Familie (Rab6b). Diese Ergebnisse wurden durch quantitative RT-PCR-Analysen von TNF-stimulierten Glomeruli und primären Mesangialzellen bestätigt. Weitere Untersuchungen zeigten allerdings auch einen Beitrag von Tnfr2 bei der gesteigerten glomerulären Expression von Adhäsionsmolekülen und Chemokine nach Stimulation mit niedrigen TNF-Konzentrationen auf. Im Gegensatz zur Wildtyp-Kontrolle fehlte in TNF-stimulierten Tnfr1-defizienten Glomeruli die Sekretion verschiedener proinflammatorischer Chemokine beinahe vollständig. Interessanterweise war die Proteinexpression auch in Tnfr2-defizienten Glomeruli signifikant herunterreguliert. Folglich sind die meisten inflammatorischen TNF-Effekte in Glomeruli via Tnfr1 durch die induzierte Expression von proinfammatorischen Mediatoren wie Adhäsionsmolekülen und Chemokinen vermittelt. Darüber hinaus dürfte Tnfr2 zu dieser inflammatorischen Antwort beitragen, wenn Glomeruli niedrigen TNF-Konzentrationen ausgesetzt sind. Ferner scheint Tnfr2 posttranskriptionell die Chemokinsekretion in Glomeruli nach einer TNF-Exposition zu beeinflussen, möglicherweise durch die Tnfr2-abhängig exprimierte Rab GTPase Rab6b, die am intrazellulären Transport und der Sekretion von inflammatorischen Molekulen beteiligt sein könnte. In Bezug auf Tnfr-spezifische, anti-inflammatorische Therapien weisen die hier präsentierten Ergebnisse somit darauf hin, dass eine selektive Tnfr1-Blockade eine glomeruläre, insbesondere durch Granulozyten und Makrophagen vermittelte Entzündung verbessern könnte, möglicherweise bei geringer Hemmung immunregulatorischer und antimikrobieller Funktionen von TNF, die redundant durch Tnfr2 vermittelt werden könnten. Dagegen erscheint aufgrund der erhobenen Daten im MRL/lpr-Mausmodell eine Blockade von TNF oder beider Rezeptoren bei der Lupusnephritis, in der glomeruläre Neutrophileninfiltrate keine entzündliche Rolle spielen, weniger erfolgversprechend. Gleichzeitig weisen die vorliegenden Ergebnisse auf eine immunsuppressive, die systemische Immunreaktivität beim SLE begrenzende Funktion von Tnfr2 hin.

The processing of APP occurs in two alternative ways: upon release of the ectodomain by α-secretase, the neuroprotective APPsα-fragment is produced. But if APP is cleaved by the β-secretase the Aβ-peptide can be produced. To be able to influence the production of Aβ-peptides, it is essential to understand how it is decided if cleavage occurs by α- or β-secretase. At present little is known about the control of the alternate processing. Until now, the molecular mechanisms and especially the responsible cellular modulators are not understood in detail or not yet identified. To get a better understanding of cellular regulatory processes and to identify novel cellular modulators of APP ectodomain shedding, the present work chose two approaches: on the one hand cellular mechanisms of TMEM59-mediated inhibition ectodomain shedding of APP were investigated. On the other hand a genome-wide RNAi screening in Drosophila cells was performed in order to identify novel cellular modulators of APP ectodomain shedding in human cells. TMEM59 was identified as a novel modulator of APP ectodomain shedding in a cDNA expression screening in the lab (Neumann et al., 2006; Schobel et al., 2008; Schobel et al., 2006). TMEM59 is a Golgi protein that inhibits on the one hand processing and maturation of APP and on the other hand Golgi glycosylation reactions (Fischer, 2008). My own work could verify these effects of TMEM59 and its homolog TMEM59L on processing and maturation of APP. In particular, it was shown that these effects are not only true for transiently expressed APP but also for endogenous levels of APP. In detailed immunofluorescence studies it was shown that TMEM59 colocalizes with different markers of the Golgi subcompartments and that therefore TMEM59 is present throughout the whole Golgi apparatus. This finding points to a more general modulation of Golgi glycosylation reactions by TMEM59. To test if TMEM59-dependet modulation of Golgi glycosylation reactions also affects APP secretases ADAM10 and BACE1, which are also glycosylated proteins, the activities of these proteases were investigated. It was shown that proteolytic activities were not changed, ruling out that impairment of secretase activities by TMEM59 could cause the observed inhibition of APP processing. But interestingly, studies of intracellular APP transport could show that TMEM59 caused retention of APP in the Golgi apparatus and blockage of transport towards the cell surface and into endosomal compartments. Since APP is cleaved by α-secretase at the plasma membrane and by β-secretase in endosomes it is likely that a TMEM59-dependent APP transport block causes the observed inhibition of APP ectodomain shedding. For further validation of TMEM59 and its homolog TMEM59L as modulators of APP ectodomain shedding, a double knockdown study was performed. In this approach effects on APP ectodomain shedding could also be established, affirming TMEM59 and its homolog TMEM59L as modulators of APP ectodomain shedding with novel cellular mechanisms. In order to identify novel cellular modulators of APP ectodomain shedding a genome wide RNAi screening in Drosophila cells was performed and candidate genes were investigated in human cells in present work. Initially a suitable Drosophila reporter cell line expressing a reporter construct of APP ectodomain shedding (HRP-APP) was established. Other constructs were used to monitor general secretion (GLuc) and transfection efficiency (FLuc). Using Kuzbanian, the α-secretase in Drosophila (Sapir et al., 2005), as a positive control guaranteed that transfection of cDNAs into Drosophila cells did not interfere with uptake of dsRNAs or efficiency of RNAi and that the reporter construct HRP-APP is normally produced and processed in reporter cells. After successful establishment of the reporter cell line the genome wide RNAi was performed in two steps: a primary screening revealed approx. 300 candidate genes out of which 43 could be confirmed in a secondary screening to be modulators of APP ectodomain shedding. The RNAi screening was verified by the several-fold appearance of Kuzbanian among the top modulators. For further investigation of the top candidates human ortholog genes were identified. The 30 human candidate genes were investigated in RNAi studies in human SH-SY5Y cells. In these cells, APP is processed by α-secretase ADAM10 as well as by β-secretase BACE1. Therefore effects on both shedding products (APPsα and APPsβ) were investigated upon depletion of candidate genes using siRNAs. It is known that siRNAs produce a high rate of off target effects, to this end a robust validation strategy was developed. Candidate genes were first depleted with two different siRNA pools and their effects on APP shedding were compared. Afterwards the remaining 12 candidate genes were depleted using single siRNA sequences and the effects were compared to those of the siRNA pool. Only when a reproduction of effects was obtained in a next step correlation of knockdown and phenotype were assessed. Using these steps of validation 5 candidate genes could be verified as modulators of APP shedding in human cells: next to genes coding for a histone protein (HIST1H4C), a ribosomal protein (RPL36AL), a protein of the minor spliceosom (ZMAT5), an unknown gene (METTL16) and the gene VPS24 („vacuolar protein sorting-associated protein 24“), coding for a protein of intracellular protein transport, were identified. VPS24 was chosen for further validation by a pathway analysis. VPS24 belongs to the ESCRT machinery („endosomal sorting complex required for transport“) and therefore participates in endosomal-lysosomal protein transport. In further RNAi studies other members of the ESCRT machinery were depleted in human cells and effects on APP shedding were compared to VPS24 depletion. For most of the ESCRT members a consistent reduction in APPsβ production could be observed. To engross these results VPS24 was depleted by using an alternative RNAi system. With this stable knockdown approach, the knockdown phenotype could be confirmed. This stepwise validation strategy for candidate genes of the initial Drosophila RNAi screening verified VPS24 as a modulator of APP ectodomain shedding in human cells.