Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/19 Archiv

Zielsetzung der Arbeit war es, zu untersuchen ob porciner Fas-Ligand auf nativen aortalen Schweineendothelzellen (PEC) und immortalisierten aortalen Schweineendothelzellen (PEC-A) exprimiert wird und ob dieser mit humanem Fas auf der T-Lymphozytenzelllinie Jurkat interagiert. Unter Einsatz von Matrix-Metalloproteinase-Inhibitoren sowie nach Permeabilisierung und Fixierung der Zellen konnte FasL sowohl auf PEC als auch auf PEC-A in geringem Maße nachgewiesen werden. Die Detektion von FasL erfolgte mit anti-FasL-AK. Bei der Koinkubation von PEC sowie PEC-A mit Jurkat-Zellen in Effektor/Target-Verhältnissen von 4:1, 3:1 und 2:1 konnte weder im APO2.7-Assay noch im Annexin-Assay Apoptose beobachtet werden. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der FACS-Analyse. Der JAM-Test erwies sich in unserem System aus technischen Gründen als nicht geeignet für den Nachweis von Apoptose. Versuche PEC-A mit hFasL zu transfizieren waren mit hoher Zelltoxizität verbunden. Der transfizierte FasL wurde teilweise auch intrazellulär gespeichert. Der costimulatorische Signalweg B7/CD28 kann ein dem Fas/FasL-Signalweg entgegengesetztes Signal vermitteln. Auch nach Blockade der möglichen Interaktion zwischen B7 auf PEC-A und CD28 auf Jurkat-Zellen konnte keine Apotose gezeigt werden.

In der vorliegenden Arbeit sollte die Auswirkung unterschiedlicher Strahlendosen auf verschiedene Kultivierungsformen der Bronchialschleimhaut und eine Lungenkarzinomzelllinie untersucht werden. Untersuchungen zur Wirkung ionisierender Strahlen auf normales Bronchialepithel sind eher selten, obwohl die Affektion von tumorfreiem umgebendem Gewebe eine wichtige Rolle bezüglich der Nebenwirkungen einer Radiotherapie spielt. Gerade im palliativen Bereich, in dem die endoluminale Bestrahlung von Bronchus-Stenosen einen wichtigen Faktor für die Verbesserung der Lebensqualität darstellt, ist durch den engen Kontakt der Strahlenquelle zum gesunden Bronchialepithel eine Strahlenauswirkung gegeben. Die bisherige Datenlage legt eine relativ hohe Strahlentoleranz des Bronchialepithels nahe. Ob sich diese Ergebnisse bestätigen lassen, sollte anhand verschiedener Bronchial-Epithel-Kultivierungsformen untersucht werden. Primäres Ziel der Untersuchung war die Frage, ob die Art der Kultivierung einen Einfluss auf die Effektivität ionisierender Strahlen hat und ob Tumorzellen eine andere Reaktion zeigen. Die verwandten Modelle waren: - BEAS-2B Zelllinien - Primärkulturen aus Patientenmaterial - dreidimensionale Organkulturen - EPLC-32M1 Tumorzelllinien Als „handelsübliche“ Bronchialepithel-Zelllinie zur Monolayer-Kultivierung wurden die BEAS-2B-Zellen verwendet, hier handelt es sich um immortalisierte, humane bronchoepitheliale Zelllinie, die mit einem Adenovirus 12-SV40 Virus-Hybrid transfiziert war. Zwar sind viele Eigenschaften der normalen Bronchialschleimhaut in diesem Modell vorhanden, aber auch genetische Abweichungen wie Veränderungen des Chromosomensatzes sind beschrieben. Mit zunehmender Passagezahl können die Zellen auch eine kanzerogene Wirkung zeigen. Zum direkten Vergleich wurden Primärkulturen aus Patientenmaterial gewonnen, welche als Monolayer kultiviert wurden. Problematisch war hier die schwierige Kultivierbarkeit. Die dreidimensionalen Organkulturen stellen vom Aufbau her eine in vivo-nahe Kulturform dar. Zentrum der Organkultur ist ein bindegewebiger Kern, welcher von einem respiratorischen Epithel umgeben ist. Morphologisch ist das kultivierte Epithel nicht von dem in vivo zu unterscheiden. Als Tumormodell wurde eine EPLC-32M1 Zelllinie verwandt, die wie die BEAS-2B Linie und die Primärkulturen als Monolayer wachsen. Hier handelt es sich um eine squamöse Karzinom Zelllinie, deren Ursprungsgewebe ein Plattenepithelkarzinom der Lunge war. Die Ähnlichkeit zum Primärtumor ist nur noch gering ausgeprägt. Bekannterweise gehört das Plattenepithelkarzinom der Lunge zu den nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen, welche im Vergleich zu Kleinzellern nur eine geringe Strahlensensitivität aufweisen. Als Parameter für die Zellschädigung wurde die Lactatdehydrogenase verwandt, ein zytoplasmatisches Enzym, welches bei Zellmembranläsionen freigesetzt wird. Mit der LDH steht ein klinisch häufig eingesetzter, etablierter Parameter zu Detektion von Zellschäden zur Verfügung. Hier konnte eine Bestimmung im Kulturmedium erfolgen, wodurch Verlaufsbeobachtungen ohne Beeinflussung der Kulturen möglich waren. Ferner wurde die Zellzahlen nach Bestrahlung ermittelt, um eine Aussage über das Zellüberleben machen zu können. Zusammenfassung der Ergebnisse: - Die Organkulturen und Primärkulturen zeigten nach einer Latenz von 48 Stunden nach der Bestrahlung eine gesteigerte LDH-Aktivität, die hier gleichzeitig ihr Maximum erreichte. - Bei der BEAS-2B Linie kam es innerhalb der ersten 24 Stunden zu einem deutlichen LDH-Anstieg. - Tumorzellen zeigten ein gänzlich anderes Verlaufsmuster bezüglich der LDH. Hier kam es nach 3 Tagen zu einem kontinuierlichen Anstieg. - Die Zellzahlen im Organkulturmodell wiesen 4 Tage nach Bestrahlung keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsgruppen auf. - Bei den Primärkulturen und den BEAS-2B Zellen fand sich in den bestrahlten Gruppen eine signifikant, nicht dosisabhängig erniedrigte Zellzahl. - Im Tumorzell-Modell war dosisabhängig eine Zellzahlminderung in den bestrahlten Gruppen zu beobachten. Schlussfolgerungen: Sowohl vom LDH-Verhalten, als auch von den Ergebnissen der Zellzahlbestimmung zeigten sich die dreidimensionalen Organkulturen wenig anfällig für die Wirkung ionisierender Strahlen. Nachdem dieses Modell die in vivo-Situation gut wiederspiegelt, unterstützen die Ergebnisse die Daten, welche eine hohe Strahlentoleranz von Bronchialepithel nahe legen. Von den übrigen Kultivierungsformen scheinen die aus Patientenmaterial gewonnenen Primärkulturen die höchste Strahlenresistenz aufzuweisen, wahrscheinlich sind hierfür Zelleigenschaften verantwortlich, die in den gentechnisch veränderten Zelllinien nicht mehr in der Art und Weise ausgeprägt sind wie in vivo. So nehmen viele intrazelluläre Faktoren wie Zytokine, Wachstumsfaktoren, Proteinkinasen oder auch Onkogene Einfluss auf die Strahlensensibilität einer Zelle. Entscheidend scheint besonders der p53- Status zu sein. Am strahlensensitivsten zeigten sich die BEAS-2B und die EPLC-32M1 Linien. Das hängt womöglich mit der Veränderung des genetischen Materials durch die Immortalisationsprozesse und die im Vergleich höhere Proliferationsrate zusammen. Möglich ist auch eine erhöhte Strahlensensibilität aufgrund des im Vergleich zu den Organkulturen schwächer ausgeprägten Zell-Zell-Kontaktes, der fehlenden dreidimensionalen Struktur und dem geringeren Anteil differenzierter Zellen. Nicht außer Acht lassen darf man individuelle Einflüsse, welche womöglich in den von Patientenmaterial stammenden Kulturen eine Rolle spielen. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass der dreidimensionale Aufbau und die hierarchische Struktur des Bronchialepithels maßgeblich die Strahlensensibilität beeinflussen. Monolayer sind zur Untersuchung von Strahlenfolgen in vivo nur sehr bedingt geeignet. Ausblick auf zukünftige Fragestellungen: Nachdem in der vorliegenden Arbeit nur eine Tumorzelllinie untersucht wurde, wäre es von Interesse, die Auswirkung ionisierender Strahlung auf verschiedene Lungenkarzinom- Zelllinien zu vergleichen, welche in vivo deutliche Unterschiede in der Strahlenempfindlichkeit aufweisen. Anbieten würde sich hier der Vergleich mit strahlensensiblen kleinzelligen Bronchialkarzinom. Möglicherweise kann auch hier eine dreidimensionale Kultivierung von Tumorzellen aus Patientenmaterial etabliert werden, um einen größeren Zell-Zell-Kontakt im Tumor-Modell zu ermöglichen. Auch wäre hier durch die fehlenden gentechnischen Veränderungen eine bessere Vergleichbarkeit mit der in vivo- Situation möglich. Auch die Untersuchung von Ko-Kulturen aus normaler Bronchialschleimhaut und verschiedenen Bronchialkarzinomzelllinien bietet die Möglichkeit, Auswirkungen von Interaktionen zwischen Normalgewebe und Tumorgewebe nach Einwirkung ionisierender Strahlen näher zu eruieren. Dieses Modell käme der Situation beim Patienten am nächsten. Interessant wäre in diesen Modellen auch die Überprüfung weiterer Zelltod-Parameter. So könnten hier verschiedene Apoptosemarker wie zum Beispiel die Nukleosomen im Überstand verschiedener Ko-Kulturmodelle bestimmt werden, um eine bessere Aussage über das Ausmaß der Zellschädigung zu erhalten. Im Kontext mit der Untersuchung von Nukleosomen scheint auch die Bestimmung von Calcium eine sinnvolle Ergänzung darzustellen. Hier bieten sich verschiedene Möglichkeiten an, das Verhalten von Zellkulturen nach Bestrahlung, gerade hinsichtlich einer möglichen Resistenzbildung zu untersuchen.

Das Wallenberg-Syndrom besteht aus einer Vielfalt neurologischer Symptome, die Adolf Wallenberg bereits 1895 sehr detailliert beschrieben und auf eine vergleichsweise winzige Läsion in der dorsolateralen Medulla oblongata zurückgeführt hat. Ein in der neueren Literatur wenig beachtetes, klinisch jedoch sehr relevantes Symptom ist die Dysphagie. Hierzu liegen sowohl hinsichtlich der Art der Störung wie auch bezüglich der Interventionsmöglichkeiten kaum systematische Untersuchungen vor. Ziel der vorliegenden prospektiven Studie war es, einerseits herauszufinden, welche Phase und Funktionen des Schluckablaufs beim Wallenberg-Syndrom beeinträchtigt sind bzw. ob es ein typisches Störungsmuster gibt und andererseits die Wirksamkeit spezifischer Schlucktherapie zu evaluieren. Es wurden 28 Patienten untersucht, die unter einer neurogenen Dysphagie litten, klinisch ein Wallenberg-Syndrom aufwiesen und bei denen kernspintomographisch eine einseitige Läsion der dorsolateralen Medulla oblongata vorlag. Hierbei zeigte sich, dass vor allem eine Störung der pharyngealen Schluckphase vorlag, was sich insbesondere in einer gestörten Schluckreflextriggerung und in einer Öffnungsstörung des oberen Ösophagussphinkters äußerte. Bezüglich der Frage nach der Effektivität einer spezifischen Schlucktherapie konnte gezeigt werden, dass die Aspirationsgefahr unter gezielter, individuell angepasster stationärer Schlucktherapie deutlich abnahm. So konnte eine signifikante Verbesserung der Hauptzielvariablen "Ernährungsweise", definiert durch eine ordinale Skala mit 7 Ausprägungsgraden von 0 (voll-oral ernährt) bis 6 (vollständige Ernährung über PEG oder nasogastrale Sonde) erreicht werden. Klinisch bedeutet dies, dass nach Schlucktherapie 21 Patienten (75,0%) voll-oral ernährt werden konnten, im Vergleich zu einem Patienten (3,6%) vor Therapie. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass beim Wallenberg-Syndrom insbesondere die Schluckreflextriggerung und die Öffnung des oberen Ösophagussphinkters gestört ist. Unter gezielter und qualifizierter Schlucktherapie kann die Prognose der Dysphagie bei Patienten mit Wallenberg-Syndrom jedoch auch bei initial schwerer bzw. bereits längere Zeit bestehender Störung als gut bezeichnet werden.

Background. Immigration of leukocytes into inflamed tissue is mediated by CC chemokines. Blockade of the CC chemokine receptor CCR1 was shown to reduce interstitial inflammation and fibrosis in murine obstructive nephropathy. However, it is not known whether CCR1 blockade is protective in progressive renal injury associated with severe proteinuria. This study therefore examines the effect of the small-molecule CCR1 antagonist BX471 in a mur-ine model of adriamycin-induced focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) with nephrotic syndrome and progressive interstitial inflammation and fibrosis. Methods. Adriamycin (ADR) nephropathy with persistent proteinuria was induced in male BALB/c mice by two intravenous injections of ADR (13 mg/kg) at day 0 and 14. BX471 treatment was started at day 14 when proteinuria had developed. At 6 weeks, renal histology was studied by morphometry and immunohistochemistry. The expression of chemokines was localised by immunohistochemistry and quantified by RNAse protection assays. The expres-sion of CCR1 in different leukocyte subsets was quantified by PCR. Results. At week 6, ADR-treated mice showed focal segmental glomerular sclerosis, associ-ated with tubulointerstitial injury consisting of tubular dilation and atrophy, interstitial leuko-cyte infiltration and fibrosis. The mRNA expression of CCR1 and CC chemokines, including the CCR1 ligands CCL3/MIP-1 and CCL5/RANTES, was upregulated in diseased kidneys, with a prominent intersitial expression of CCL5/RANTES. The mayor CCR1-expressing cell subset were F4/80-positive macrophages. Compared to vehicle-treated controls BX471 sig-nificantly reduced the amount of macrophages and T lymphocytes in interstitial lesions by 51 % and 22 %, respectively. Markers of renal fibrosis such as interstitial fibroblasts (48 %) and interstitial volume (23 %) were significantly reduced by BX471 treatment. In contrast, the extent of proteinuria and glomerular sclerosis was not affected by BX471 treatment. Conclusion. Blockade of CCR1 substantially reduced interstitial leukocyte accumulation and the subsequent renal fibrosis in a murine model of nephrotic syndrome and FSGS. These find-ings support a role for CCR1 in interstitial leukocyte recruitment and suggest that CCR1 blockade might be a new therapeutic strategy in progressive nephropathies such as FSGS.

Oxidative Veränderungen von LDL-Partikeln und Aktivierung der Blutplättchen spielen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung von Herz-Kreislauferkrankungen. Lysophosphatidsäure (LPA) ist eine thrombogene Substanz, die in oxidativ modifizierten LDL-Partikeln (mox- LDL) und atherosklerotischen Läsionen enthalten ist. Kurzkettige Analoga von Phosphatidsäure wurden auf ihren Effekt auf zwei initiale thrombozytäre Antworten, Gestaltwandel (shape change) und Ca2+-Mobilisation, untersucht. Dioctylglycerol Pyrophosphat [DGPP(8:0)] und Dioctyl-Phosphatidsäure [PA(8:0)], die kürzlich als selektive Antagonisten des LPA1- und LPA3-Rezeptors beschrieben wurden, inhibierten spezifisch die Thrombozytenaktivierung durch LPA. DGPP (8:0) war hierbei ein potenterer Antagonist als PA (8:0). DGPP (8:0) hemmte auch den thrombozytären shape change durch mox-LDL und Lipidextrakte aus humanen atherosklerotischen Plaques. Bemerkenswerterweise konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass der lipidreiche Kern atherosklerotischer Plaques direkt den shape change induzierte. Dieser Effekt war durch Vorinkubation mit DGPP (8:0) vollständig zu hemmen. Überdies konnte durch gemeinsame Gabe des lipidreichen Kerns oder LPA mit unterschwelligen Konzentrationen ADP oder Adrenalin eine deutliche synergistische Aggregation hervorgerufen werden, welche wiederum durch DGPP (8:0) gehemmt werden konnte. Durch Analyse von Plaquematerial mittels Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie ließen sich besonders potente Thrombozyten-aktivierende LPA-Spezies (16:0-alkyl-LPA und 20:4-acyl-LPA) identifizieren. Homogenate des gesamten atheromatösen Plaques induzierten Aggregation, die nicht mit dem LPA-Gehalt der Plaques korrelierte. Maßgeblich für die Aggregation schienen v.a. Matrixbestandteile, wie Kollagen zu sein. Im Rahmen von Untersuchungen zur klinischen Bedeutung von LPA fand sich bei Patienten mit Carotisstenosen, die eine Hypercholesterinämie hatten, ein signifikant höherer Gehalt an LPA im Plaquematerial als bei Patienten mit normalen Cholesterinwerten. Außerdem reagierten Thrombozyten von Patienten mit manifester Atherosklerose sensitiver auf LPA als Blutplättchen von gesunden Probanden. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass LPA eine Schlüsselrolle bei der Thrombozytenaktivierung durch den vulnerablen Lipidkern atherosklerotischer Läsionen besitzt. LPA-Moleküle des lipidreichen Kerns induzierten eine rasche Plättchenaktivierung, wahrscheinlich über Aktivierung von LPA1- und LPA3-Rezeptoren. Spezifische Antagonisten der thrombozytären LPA-Rezeptoren könnten als wirkungsvolle Inhibitoren der arteriellen Thrombusbildung bei Patienten mit kardiovaskulären Krankheiten dienen.

Die nekrotisierende Fasziitis ist eine seltene, ungewöhnlich schwere Entzündung der Faszien und des Subkutangewebes. Ursache ist eine meist polymikrobielle Infektion. Schwierig ist eine frühzeitige Abgrenzung von der Zellulitis, einer subkutan begrenzten Phlegmone. Die Therapie der nekrotisierenden Fasziitis besteht in der frühen Einleitung aggressiver chirurgischer Maßnahmen zur Sanierung des betroffenen Gewebes mit wiederholten Debridements und intravenöser Gabe von Breitspektrum-Antibiotika. Wird die nekrotisierende Fasziitis nicht frühzeitig therapiert, so zeichnet sie sich durch eine hohe Mortalitätsrate von 30 bis 50 % aus. Mit Hilfe dieser Arbeit sollte die Frage beantwortet werden, ob die Messung von Serumzytokinen zu einer frühzeitigen Diagnosefindung und Abschätzung der Prognose bei nekrotisierender Fasziitis beitragen kann. Grundlage der vorliegenden Arbeit ist eine prospektive klinische Studie, in der über maximal 36 Stunden nach Aufnahme das Zytokinprofil mit Hilfe der Elektrochemilumineszenzmethode von Patienten mit Verdacht auf nekrotisierende Fasziitis bestimmt wurde. Bei fünfzehn von zwanzig Patienten wurde die Diagnose nekrotisierende Fasziitis bestätigt, fünf Patienten hatten eine Zellulitis und weitere fünf Patienten mit Myokardinfarkt wurden als Vergleichspatienten eingeschlossen. Bei den fünf Patienten mit tödlichem Ausgang der nekrotisierende Fasziitis waren im Vergleich zu den Überlebenden bei Aufnahme die Serumspiegel für Interleukin-1β, Interleukin-1-Rezeptorantagonist, Interleukin-18 und Interferon-γ, sowie die Anzahl der Blutleukozyten signifikant erhöht. Interleukin-1-Rezeptorantagonist und Leukozytenzahl waren ebenso höher als bei den Patienten mit Zellulitis. Für Interleukin-6 und Interleukin-8 wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Patientengruppen gesehen. Bei allen Patienten mit nekrotisierender Fasziitis korrelierten die Serumspiegel für die Zytokine der Interleukin-1-Familie – Interleukin-1β, Interleukin-1 Rezeptor-Antagonist und Interleukin-18 –positiv mit der Anzahl der Leukozyten bei Aufnahme. Darüber hinaus war bei Aufnahme die Infektion mit Staph. aureus in Patienten mit nekrotisierender Fasziitis mit erhöhten Werten für Interleukin-1β und Interleukin-18 assoziiert. Zusammenfassend ist festzustellen, dass erhöhte Serumspiegel von Interleukin-1β, Interleukin-18, Interferon-γ und insbesondere Interleukin-1-Rezeptor-Antagonist mit tödlichem Ausgang der nekrotisierenden Fasziitis assoziiert sind. Die vorliegende Arbeit gibt Hinweise darauf, dass die Messung dieser Zytokine zu einer frühzeitigen Diagnosefindung und Abschätzung der Prognose bei nekrotisierender Fasziitis beitragen könnte und daraus resultierend durch frühzeitige Einleitung einer aggressiven Therapie zu einer Verbesserung der Überlebensrate führt. Da der Interleukin-1-Rezeptor-Antagonist sowohl eine Differenzierung zwischen den Überlebenden und den Verstorbenen mit nekrotisierender Fasziitis, wie auch eine Unterscheidung zwischen Zellulitis und nekrotisierender Fasziitis zulässt, sollte vor allem auf die Messung dieses Zytokins ein Hauptaugenmerk gelegt werden. Solange noch keine schnelle, zuverlässige Methode zur Messung von Interleukin-1 Rezeptor-Antagonist verfügbar ist, sollte eine ausgeprägte Leukozytose ohne Fieber bei entsprechender klinischer Symptomatik den Verdacht auf nekrotisierende Fasziitis lenken. In diesem Fall ist ein rasches operatives Vorgehen gerechtfertigt, um die Prognose des Patienten zu verbessern.

In dieser Arbeit entwickelten und synthetisierten wir ein Tetramer des Kernsignales des großen T-Antigens des SV40 Viruses (PKKKRKV). Dadurch erhielten wir einen neuen nicht-viralen Vektor (NLSV404). Diese 4,4 kDA großen Peptide enthalten hauptsächlich die positiv geladene Aminosäure Lysin und komplexieren DNS durch elektrostatische Anziehungskräfte. Durch die Komplexierung wird die DNS vor dem Abbau durch DNasen geschützt. NLSV404 zeigt Eigenschaften eines Kerntransportsignals, welches wir durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung bestätigen konnten. Des Weiteren transfizierten Komplexe aus DNS und NLSV404 viele verschiedene Zelllinien, wie z.B. 16HBE14o-, HeLA S6 und Cos7 Zellen. Vergleiche der Transfektionseffizienz von NLSV404 Komplexen mit Komplexen, die aus der Mutante der Kernlokalisierungssequenz des T-Antigens gebildet wurden (cNLS, fungiert nicht mehr als Kernlokalisierungssignal), resultierten in einer mindestens 20-fach höheren Transfektionsrate. Hingegen waren NLSV404 Komplexe mindestens 100-mal effizienter als cNLS Komplexe, wenn man die Versuche mit Zellen durchführte, die in ihrer Zellteilung gehindert wurden. Die Inkubation von Zellen mit freiem NLSV404 vor der Transfektion der Zellen mit NLSV404 Polyplexen hatte einen dramatischen Einbruch in der Transfektionseffizienz zur Folge, welches Rückschlüsse auf einen kompetitiven Hemmungsmechanismus zulassen. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass NLSV404 ein viel versprechender nicht-viraler Genvektor ist.

In der allgemeinen gesundheitspolitischen Diskussion allgemeiner Kostenreduktion steht unter ökonomischer Perspektive die Dauer der stationären Behandlung im Mittelpunkt des Interesses und nimmt bei den in der somatischen Medizin seit 2004 in Deutschland eingeführten Fallpauschalensystem der DRGs eine zentrale Rolle in der Festlegung der Behandlungskorridore ein. Wenn auch zur Zeit die psychiatrischen und psychosomatischen Erkrankungen vom Fallpauschalensystem ausgenommen sind so wird doch mit ihrer Einführung in den nächsten Jahren gerechnet. Die vorgelegte retrospektive Studie untersucht 9 Jahrgänge stationär behandelter Patienten des BKH Haar. Insgesamt wurden 27528 stationär psychiatrische Krankenhausbehandlungen auf die Zusammenhänge zwischen Behandlungsdauer und Wiederaufnahmerate mit soziodemographischen und krankheitsbezogenen Variablen der Patienten analysiert. Die vorliegende Studie findet eine deutliche Abhängigkeit der Therapiedauer und Wiederaufnahmewahrscheinlichkeit von individuellen patientenbezogenen Merkmalen wie der Schwere des psychopathologischen Befundes, der eingesetzten Medikation, deren Komplikationen un der Einbindung der Patienten in extramurale Versorgungsstrukturen sowie der allgemeinen Funktionsfähigkeit im alltäglichen Leben, nicht so sehr der Diagnose. Zudem nimmt der Schweregrad der Erkrankung als Prädiktor eine wichtige Rolle ein. Die Ergebnisse der Analyse zur Prädiktion der Wiederaufnahme zeigen, dass ähnlich wie zur Vorhersage der Behandlungsdauer Merkmale der Medikation und der Weiterbetreuung die Wahrscheinlichkeit einer Wiederaufnahme erhöhen bzw. reduzieren. Ein für das BKH Haar interessanter Befund dabei ist, dass die Weiterleitung und Einbindung eines Patienten in die hauseigene Ambulanz die Wahrscheinlichkeit für eine stationäre Wiederaufnahme erhöht, was dem Modell einer Verhinderung bzw. Verminderung stationärer Aufenthalte durch ambulante Betreuung widerspricht. Ein höheres Risiko für eine Wiederaufnahme haben außerdem Patienten mit alkoholbedingten und komorbiden Störungen, früheren Suizidversuchen, Complianceproblemen, Entlassung gegen den ärztlichen Rat und fehlender komplementärer Weiterversorgung. Ein Zusammenhang zwischen kürzerer Behandlung und steigender Wiederaufnahmerate ist erkennbar. Das Risiko einer häufigen Inanspruchnahme stationärer Behandlung wird durch die Anzahl vorausgegangener Aufenthalte prädiziert, genauso wie durch das Maß der psychosozialen Anpassung und das Vorhandensein von anderen Versorgungsstrukturen. Bestätigt werden konnte auch, dass ein kleiner Teil der Patienten für einen Großteil der Nutzung der stationären Psychiatrie verantwortlich ist, in der vorliegenden Studie verbrauchen 13% der Patienten mit 3 oder mehr Aufnahmen 38% der Ressourcen.

Die Stigmatisierung psychisch Kranker wirkt sich negativ auf die Inanspruchnahme psychiatrischer Hilfe, den Erfolg ihrer Behandlung und den Erhalt sozialer Kontakte aus. Zahlreiche Aktionen versuchen, diesem Sachverhalt entgegen zu wirken und es liegen etliche Studien vor, die die Entwicklung der Bevölkerungseinstellungen gegenüber psychisch Kranken untersuchen. Ziel dieser Arbeit war es, Einstellungen einer Stichprobe der Münchner Bevölkerung zum Thema Schizophrenie zu erfassen und eine Beurteilung der Plakataktion „Künstler gegen Stigma“, die im Rahmen eines Antistigmaprogramms im Sommer 2002 durchgeführt wurden, zu bekommen. Es wurde eine Passantenbefragung mit 100 Personen anhand von fünf offenen Fragen in Form eines Leitfadeninterviews durchgeführt, die folgende Aspekte genauer beleuchten sollte: • Einstellung, Wissen und potentielle Vorurteile • Soziale Distanz • Gestaltung und Aussage des Plakats • Medienwirksamkeit des Plakats • Anti-Stigma-Ideen Die Antworten der Befragten wurden inhaltsanalytisch ausgewertet. Die wichtigsten Ergebnisse zeigen, dass die Mehrheit der Befragten Schizophrenie mit gespaltener Persönlichkeit und Geisteskrankheit gleichsetzte. Über 80% der Befragten sprachen sich für das Eingehen einer Freundschaft mit einem Schizophrenen aus. Bei erweitertem Wissensstand der Befragten nahm die soziale Distanz ab. Eher negativ wurde das Plakat der Antistigmaaktion bewertet. Vielen Befragten war unklar, welche Botschaft sich hinter der „komplizierten“ Gestaltung verbarg. Hingegen wurde die Medienwirksamkeit von Plakaten allgemein und der Sinn dieser Plakataktion überwiegend positiv eingeschätzt. Die Befragten schätzten das Vorhandensein von Vorurteilen in der Gesellschaft als sehr hoch ein. Fast alle Probanden gingen von in der Gesellschaft verankerten Vorurteilen gegenüber schizophrenen Menschen aus. Das häufigste angenomme Vorurteil war die „Gefährlichkeit“ der Schizophrenen, gefolgt von „Verrücktheit“ . „Andersartigkeit“, „Dummheit“ oder „Eigenverschulden“. Die Möglichkeiten zum Abbau von Vorurteilen sahen die Befragten vor allem in einer stärkeren Aufklärung der Bevölkerung in Form von Informationsveranstaltungen, dem Einsatz verschiedenster Medien und durch die Herstellung von Kontakten zu Schizophrenen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass in der Bevölkerung ein deutlicher Aufklärungsbedarf zum Thema Schizophrenie besteht. Die Änderung von Vorurteilen gegenüber schizophren Erkrankten ist jedoch ein schwieriger und langwieriger Prozess. Nur durch langfristige und routinemässige Aufklärungsarbeit lässt sich dauerhaft eine Entstigmatisierung schizophren Erkrankter erreichen.

Charakterisierung der Protease Calpain und ihres zellulären Verteilungsmusters in Abhängigkeit von der Reperfusionsdauer. Steigender Anteil nicht-neuronaler Zellen, v.a. Endothelzellen und Mikroglia, mit zunehmender Dauer. Größte Fraktion stellen die Neuronen dar. Desweiteren Einfluß von rtPA und Hypothermie auf Calpainaktivität. rtPA führt dosisunabhängig nicht zu erhöhter Calpainaktivität, Hypothermie verringert die Aktivität signifikant, ebenso Kombination aus rtPA/Hypothermie.

Die gamma-Sekretase ist ein Proteasekomplex, der aus vier Komponenten, Presenilin (PS), Nicastrin (NCT), APH-1 und PEN-2, besteht und der die intramembranöse Prozessierung verschiedener Typ I Transmembranproteine, einschliesslich des Alzheimer-assoziierten beta-Amyloid Vorläuferproteins, katalysiert. In der vorliegenden Arbeit wurden stabile PEN-2 RNAi-Knockdown Zellen (PEN-2KD) dazu verwendet, um Hinweise auf die Funktion von PEN-2 bei der Assemblierung und Reifung des gamma-Sekretasekomplexes, die Rolle von PEN-2 im aktiven Komplex und für die gamma-Sekretaseaktivität zu erhalten. Zusätzlich wurden, vor dem Hintergrund des PEN-2KD, RNAi-resistente PEN-2 Varianten analysiert, die in einer Struktur- /Funktionsanalyse auf ihre Fähigkeit hin untersucht wurden, den Defekt des PEN- 2KD aufzuheben, um damit funktionell wichtige Domänen im PEN-2 Protein zu identifizieren. Der Knockdown von PEN-2 war mit gestörter Reifung von NCT und blockierter PS Endoproteolyse assoziiert. PS akkumulierte als Vollängenprotein (PSholo), das durch Komplexbildung mit NCT und APH-1 stabilisiert wurde. In Abwesenheit von PEN-2 können PS, NCT und APH-1 zu einem trimeren Komplex assemblieren, PEN- 2 ist danach allerdings notwendig, um die Reifung des gamma-Sekretasekomplexes durch Initialisierung der PS Endoproteolyse einzuleiten. Interessanterweise bewirkte der Knockdown von PEN-2 auch in Endoproteolyse defizienten SwAPP/PS1 deltaExon9 Zellen einen Defekt in der Reifung von NCT. Dies schlägt eine generelle Rolle von PEN-2 bei der Reifung und für die Aktivität der gamma-Sekretase vor, die unabhängig von der PS Endoproteolyse ist. Die Defekte des PEN-2KD konnten effektiv durch RNAi-resistentes wt-PEN-2 revertiert werden. In der folgenden Struktur-/Funktionsanalyse erwies sich am N-Terminus mit einem Epitop-tag verlängertes PEN-2 als voll funktionell, wohingegen sowohl die Verlängerung des C-Terminus mit einem tag, als auch eine Trunkierung des C-Terminus (PEN-2 deltaC) defekte PEN-2 Varianten hervorrief. Diese konnten zwar die Akkumulation von PSholo, die mit dem Knockdown von PEN-2 assoziiert war ausgleichen, konnten aber weder normale Spiegel an PS-NTF und -CTF herstellen, noch für eine Reifung von NCT sorgen. PEN-2 deltaC war sehr instabil und wurde schnell vom Proteasom abgebaut, was mit der Unfähigkeit einen stabilen gamma-Sekretasekomplex zu bilden konsistent war. Zusätzlich verursachte die Expression von PEN-2 deltaC eine selektive Instabilität des PS-NTF/-CTF Heterodimers, das ebenfalls vom Proteasom abgebaut wurde, wohingegen NCT und APH-1 stabil blieben. Der C-Terminus von PEN-2 ist nicht für die Einleitung der PS Endoproteolyse notwendig. Danach wird er allerdings benötigt um die entstandenen PS Fragmente und PEN-2 selbst im Komplexzu stabilisieren. Um den PEN-2 C-Terminus genauer zu untersuchen, wurden unterschiedliche Deletionen und Mutationen mehrerer konservierter Aminosäuren, im PEN-2KD auf funktionelle Aktivität hin analysiert. Progressive Verkürzung des C-Terminus bewirkte einen zunehmenden Funktionsverlust. Dieser wurde auch bei einer internen Deletion oder der groben Verdopplung der Länge durch einen Epitop-tag beobachtet. Interessanterweise störte nur die kombinierte, nicht aber die einzelne Mutation der konservierten Aminosäuren D90, F94, P97 und G99 die Funktion von PEN-2. Alle funktionslosen Mutanten erlaubten zwar die PS Endoproteolyse, die PS Fragmente und PEN-2 selbst waren aber instabil und wurden durch das Proteasom abgebaut. Länge und gesamter Sequenzkontext des PEN-2 C-Terminus sind also, in der engen räumlichen Anordnung der Komplexpartner, für die Stabilisierung des PS-NTF/- CTF Heterodimers und von PEN-2 selbst im gamma-Sekretasekomplex notwendig. Die Interaktion der C-terminalen PEN-2 Mutanten mit den PS Fragmenten und den anderen beiden Komplexpartnern konnte allerdings unter Bedingungen, wo der proteasomale Abbau blockiert war, wiederhergestellt werden. Somit wurde ein Komplex aus allen vier essentiellen gamma-Sekretasekomponenten stabilisiert und isoliert, der zwar vollständig assembliert, aber noch nicht komplett gereift war. Dieser prämature Komplex zeigte noch keine gamma-Sekretaseaktivität, für welche sowohl die vollständige Assemblierung der Komponenten, als auch deren komplette Reifung essentiell sind. Zusammenfassend schlagen die vorliegenden Daten folgende Funktionen für PEN- 2 im gamma-Sekretasekomplex vor: PEN-2 wird für die Reifung des gamma-Sekretasekomplexes und die Einleitung der PS Endoproteolyse benötigt. Darüber hinaus stabilisiert PEN-2 die, durch die Endoproteolyse entstandenen PS Fragmente im Komplex. Für letztere Funktion ist ein in Länge und Gesamtsequenzkontext intakter C-Terminus wichtig, der allerdings für die Einleitung der PS Endoproteolyse nicht benötigt wird. Unabhängig von der Rolle bei der PS Endoproteolyse ist PEN-2 aber generell für die Reifung und Aktivität des gamma-Sekretasekomplexes wichtig.

Functional inactivation of the transcription factor CAAT Enhancer Binding Protein Alpha (C/EBPα) either by mutation or direct protein-protein interaction leads to acute myeloid leukemia (AML), whereas the activation of C/EBPα restores normal myeloid cell differentiation. We and others have shown that protein-protein interactions of C/EBPα play a pivotal role in myeloid differentiation and AML. In the present study we applied proteomics based mass spectrometry to identify C/EBPα interacting proteins on a proteome-wide scale. For this, the GST and GST-DNA binding domain of C/EBP (GST-DBD) was incubated with nuclear extracts of U937 cells. Interacting proteins separated by two-dimensional gel electrophoresis were identified by MALDI-TOF mass spectrometry. Using this approach we could identify PAK6, MADP-1, ZNF45 and the c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1) as C/EBPα interacting proteins. Since JNK1 activates c-Jun, the contra-player for C/EBPα, we hypothesized that the JNK1 and C/EBPα interaction might have some biological relevance. We could show that JNK1 binds to the DNA binding domain of C/EBP in GST-pull-down and to the C/EBPα in co-immunoprecipitation assays in-vitro and in-vivo respectively. JNK1 phosphorylates and increases the half life of the C/EBPα protein via inhibiting its ubiquitination and thereby enhances its transactivation and DNA binding activity. Furthermore, JNK mRNA expression as well as its kinase activity is lower in the AML patients in comparison to normal bone marrow mononuclear cells which implicates a possible mechanism of C/EBPα inactivation in certain acute myeloid leukemia subtypes. Thus our data suggest that a JNK activity is required for C/EBPα activation in myeloid cells and a loss of JNK regulated C/EBPα expression may contribute to leukemogenesis.

Die Diagnose der nicht-erosiven Refluxkrankheit der Speiseröhre war bislang eine Ausschlussdiagnose und basierte nicht auf endoskopischen Befunden. Die neueste und derzeit für wissenschaftliche Studien geforderte Klassifikation der Refluxösophagitis ist die 1994 vorgestellte Los Angeles Klassifikation. Bei der Erarbeitung dieser neuen Klassifikation wurden auch minimale reflux-assoziierte nicht-erosive Veränderungen des distalen Ösophagus evaluiert, aber aufgrund der hohen Interobserver-Variabilität nicht in die neue Klassifikation aufgenommen. In der vorliegenden Arbeit wird, im Licht einer während 10 Jahren deutlich verbesserten Videoendoskopie, der Frage der endoskopischen Diagnose von minimalen nicht-erosiven reflux-assoziierten Veränderungen des distalen Ösophagus erneut nachgegangen. In einem Zentrum wurden von einem erfahrenen Untersucher (> 3000 Gastroskopien) konsekutiv erwachsene Patienten im Alter von > 18 Jahren und < 80 Jahren mit reflux-verdächtigen Symptomen untersucht. Die Endoskopien wurden mit der neuesten Generation von Pentax Video-Gastroskopen der Serie EG2970K durchgeführt. Die Dokumentation der minimalen nicht-erosiven Veränderungen an der Epithelgrenze erfolgte mit einem Sony Colour Video Printer UP-2300P. Anschliessend wurden 4 Quadrantenbiopsien an der Epithelgrenze durchgeführt, die Zylinderepithel, die Z-Linie und Plattenepithel möglichst in einem Partikel erfassen sollten. Die histologische Graduierung erfolgte entsprechend den in der Arbeit von Vieth et al. (Scand J Gastroenterol 2001; 36:1123) publizierten Kriterien der Arbeitsgruppe von Prof. Stolte. Als Positiv-Kontrollen wurden Patienten mit erosiver Refluxösophagitis untersucht. Anacide Patienten, entweder mit atrophischer Autoimmungastritis im Endstadium oder mit einem Zustand nach Gastrektomie wurden als Negativ-Kontrollen verwendet. Insgesamt wurden 235 Patienten untersucht. Davon hatten 41 eine endoskopisch ’normale’ Z-Linie (= Gruppe 1). 117 Patienten mit Refluxsymptomen hatten minimale nicht-erosive Veränderungen im Bereich der Z-Linie (= Gruppe 2) und 53 hatten eine erosive Refluxösophagitis im Stadium A oder B entsprechend der Los Angeles Klassifikation (= Gruppe 3). Als anacide Kontrollen wurde 11 Patienten mit atrophischer Autoimmungastritis untersucht (= Gruppe 4) und 13 mit einem Zustand nach Gastrektomie (= Gruppe 5). Die histologischen Veränderungen im z-linien nahen Plattenepithel wurden unter dem Begriff ’hyperregeneratorische Ösophagopathie’ zusammengefasst. Ihre semi-quantitative Bewertung in gering-, mittel- und hoch-gradig ergab einen Median von 1 (= gering-gradig) für Gruppe 1, von 1 für Gruppe 2, von 2 für Gruppe 3 und von 0 für Gruppe 4 und 0 für Gruppe 5. Die Unterschiede zwischen den Negativ-Kontrollen und den Gruppen 1 bis 3 waren signifikant auf dem Level p < 0,001. Ebenfalls waren die Unterschiede zwischen der Positiv-Kontrolle und den Gruppen 1 und 2 signifikant. Die Diagnose NERD wurde insgesamt bei 113 von 158 Patienten (72.5 %) richtig gestellt. Die vorliegende Untersuchung zeigt, dass mit Hilfe der neuesten Generation Videogastroskope endoskopisch minimale Veränderungen im Bereich der Z-Linie diagnostiziert werden können, die erlauben, die Diagnose NERD positiv zu stellen. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die hier formulierten Kriterien zu bestätigen und zu etablieren.