Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06 Archiv

Orc6 is a crucial component of the replication initiation machinery in eukaryotes. Its study helps us to better understand one of the most basic cell functions: DNA replication. The first step in replication initiation is the assembly and DNA binding of the origin recognition complex (ORC). Although members of ORC are highly conserved and well studied, Orc6 evolved faster than the other members of the complex, has a different structure and is less well understood than Orc1-5. The low number of studies on Orc6 in human cells and the low predictability of results obtained from model systems necessitates an in depth analysis of HsOrc6. The aim of this study is to better understand the role of Orc6 in the human cell by exploring the mechanism of Orc6-Orc1-5 interaction and Orc6-DNA binding, studying the function of Orc6 in live cells, and mapping its interaction network to find new pathways and functions of the protein. The study concludes that Orc6 interacts via its C terminus with Orc1-5 in vitro. It might also have a second pre-RC interaction domain, probably close to the nuclear localization signal. Orc6 is not required for Orc1-5-DNA binding, but is able to enhance the process in vitro. It is also able to bind DNA in the absence of Orc1-5 with high affinity. In vivo experiments present evidence on the ability of Orc6 to recruit the replication machinery to itself on DNA. Although this ability is less efficient than that of EBNA1, a viral factor, it is sufficiently strong to support autonomous replication of plasmids in human cell lines for at least four weeks. Truncated variants of the protein containing at least one of the predicted Orc1-5 interaction sites are sufficient to allow replication. This finding can be used to design autonomous-replicating plasmids for use in gene therapy. Mapping the interaction network of Orc6 leads to the conclusion that HsOrc6 is only weakly attached to pre-RC factors, and is likely to have an important role in mitosis and possibly be involved in other pathways.

Während prähistorische, römische, frühgeschichtliche und mittelalterliche Skelettfunde seit jeher das Untersuchungsgut der physischen Anthropologie mit dem Ziel der Rekonstruktion von menschlicher Bevölkerungsentwicklung in Zeit und Raum darstellt, ist die anthropologische Bearbeitung neuzeitlicher und insbesondere spätneuzeitlicher Skelettserien bis heute weltweit sehr selten, was u. a. mit deren Verfügbarkeit zu begründen ist, denn in der Regel ist die Wiederbestattung der Skelette bei lebenden Angehörigen gewünscht und üblich. Mit der Skelettserie des Kirchhofs von St. Pankratius von Altdorf bei Düren in Nordrhein-Westfalen liegt daher ein sehr seltenes Untersuchungsgut aus dem 19. Jahrhundert vor. Die anthropologische Bearbeitung und Interpretation der Ergebnisse wird unter besonderer Berücksichtigung einer modernen Umwelt vorgenommen, die, was die politische, wirtschaftliche und soziale Lage der Gesamtbevölkerung betrifft, zum Teil schriftlich gut dokumentiert ist. Die sich entwickelnden Unterschiede der Lebensbedingungen in der Zeit des demographischen Übergangs in Deutschland bedürfen einer profunden Recherche, um die anthropologischen Daten interpretieren zu können. Dabei konnten die Skelette aufgrund der Grablage in zwei zeitlich aufeinanderfolgende Populationen eingeteilt werden, die zeitlich zum einen vor dem demographischen Wandel und zum anderen während des demographischen Wandels lebten. Damit war es möglich, Trends und Entwicklungen des ersten demographischen Übergangs in Deutschland, die aus schriftlichen Quellen und theoretischen Ansätzen bekannt sind (z.B. Ehmer 2004, Imhof 1975, 1981) am vorliegenden Skelettmaterial zu überprüfen. Das erhalten gebliebene Material umfasste nicht nur Knochen und Zähne, sondern auch zahlreiche Artefakte, die in Befund und Interpretation übernommen wurden. Dazu gehören unter anderem auch Gewebe aus Keratin, wie Nägel und Haare, aber auch Zeichen von medizinischer Versorgung, wie Zahnbehandlungen und Prothesen. Aufgrund der beginnenden Industrialisierung in Deutschland und Fortschritten in der medizinischen Versorgung, änderten sich die Arbeits- und Lebensbedingungen sowie die Lebensqualität und Lebenserwartung des Menschen. Dessen Zusammenspiel mit seiner Umwelt aus seiner Biologie heraus zu verstehen und gleichzeitig die kulturellen und wirtschaftlichen Aspekte mit einzubeziehen ist unter anderem das Ziel dieser Arbeit.

Neuronal cell adhesion molecules have recently been put into the spotlight of preclinical and clinical research as potential candidates for the mediation of stress effects on brain function and behavior. The stress-induced remodeling of neuronal circuits for structural and functional changes is triggered by the reorganization of synaptic connections, a process that is potentially mediated by neuronal cell adhesion molecules. Disturbances in neuronal connectivity, induced by genetic and/or environmental influences, may cause behavioral dysfunctions related to neuropsychiatric disorders. Understanding the actions of these molecules at the synapse may thus provide insights into fundamental processes of synaptic cell adhesion and connectivity, but moreover help to elicit the molecular mechanisms underlying synapse properties and function. In this thesis, I investigated the involvement of two candidate molecules, NCAM and Neuroligin-2, in stress and social behavior. Concerning NCAM, I could show that diminished expression in the forebrain renders individuals more vulnerable to chronic stress in adulthood. In detail, I extended the knowledge about NCAM by examining the impact of a conditional NCAM-knockout on emotional and aggression-related behavior in the interplay with stress. Further, I investigated the role of neuroligin-2 in mediating the effects of early-life stress on social behavior, social cognition and aggression. Therefore, I characterized and validated an early-life stress model on alterations of social behavior in adulthood and identified neuroligin-2 as potential mediator of the stress effects and behavioral alterations. I could show that neuroligin-2 expression in the hippocampus critically impacts on social behavior, rendering it a promising target for therapeutic interventions. The findings presented in my thesis clearly demonstrate a crucial role of neuronal cell adhesion molecules in stress, social behavior, especially aggression, and social cognition, and provide an encouraging foundation for future research on novel treatment strategies for neuropsychiatric disorders based on the molecular actions and interactions of neuronal cell adhesion molecules.

Die Plasmamembran lebender Zellen stellt die Hauptbarriere für alle Arten von extrazellulären Signalen dar. Viele davon werden ins Innere der Zelle weitergeleitet, hier lösen sie im Kern transkiptionelle Veränderungen und damit die Anpassung der Zelle auf Proteinebene aus. Andere wiederum werden direkt erkannt und in unmittelbare molekulare Antworten umgewandelt, wie zum Beispiel die Sekretion von gespeicherten Stoffen oder Konformations-änderungen von Proteinen. Besonders in Pflanzen, welche durch ihre sesshafte Lebensweise auf die rechtzeitige und spezifische Erkennung von Umweltveränderungen angewiesen sind, hat sich ein höchst diverses Rezeptorsystem entwickelt. In der Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana, der in dieser Arbeit verwendeten Modellpflanze, wurden 610 verschiedene Rezeptorproteine identifiziert, welche wiederum von zahlreichen interagierenden, und bis jetzt weitestgehend unerforschten Proteinen reguliert werden. Als entscheidendes Prinzip, dieses Aufgebot an membran-gebundenen Komponenten von Signalkaskaden zu organisieren, gilt inzwischen die zeitliche und lokale Kompartimentierung der Plasmamembran. Durch Akkumulation relevanter Bestandteile von biologischen Prozessen in sogenannten Membrandomänen werden kurze Reaktionszeiten und die unmittelbare Signalweiterleitung garantiert. Besonders wichtig bei solchen Prozessen sind sogenannte Gerüstproteine, welche als Adaptoren zwischen anderen Komponenten fungieren. In dieser Arbeit wurden Remorine, eine Familie pflanzenspezifische Proteinen ohne bisher definierte Funktion, aufgrund ihrer Eigenschaft Membrandomänen zu markieren und ihrer mutmaßlichen Beteiligung an Pflanzen-Pathogen-Interaktionen, genauer untersucht. Eine systematische Expression von Remorinen als Fluorophor-Fusionen mit anschließender hochauflösender mikroskopischer und quantitativer Untersuchung offenbarte, dass die meisten Remorine sich in deutlich unterschiedlichen Mustern an der Membran verteilen. Untersucht wurden dabei Parameter wie die Größe der erkennbaren Domänen, die Form, die Helligkeit, aus welcher auf die Proteinkonzentration rückgeschlossen werden kann, sowie die Domänendichte an der Membran. Diese Ergebnisse wurden von Kolokalisationsanalysen unterstützt, welche die Lokalisation in unterschiedlichen, koexistierenden Membrankompartimenten erkennen ließen. Ferner wurden die Eigenschaften der von Remorinen markierten Membrandomänen, wie zum Beispiel der Austausch an Proteinen mit der umgebenden Membran, sowie lokale und zeitliche Dynamik und Stabilität untersucht. Dabei konnte eine hohe Fluktuation einzelner Proteine zwischen Domäne und umliegender Membran, jedoch eine klare laterale Immobilität der gesamten Domäne nachgewiesen werden. Zusätzlich zeichneten sich die untersuchten Domänen teilweise durch eine außerordentlich große zeitliche Stabilität aus, andere wiederum scheinen abhängig von bestimmten Stimuli zu entstehen. Weitergehende Arbeiten dienten der Identifizierung der Funktion einzelner Bereiche der Proteine. Hierbei konnte die entscheidende Rolle des äußersten C-terminalen Bereichs, des so- genannten RemCAs (Perraki et al., 2012; Konrad et al., 2014) als Membrananker bestätigt werden. Zusätzlich wurden mit Hilfe eines Hefe-2-Hybrid Ansatzes zahlreiche neue Interaktoren für eine Auswahl von Remorinen identifiziert. Dabei wurde ein essentieller Rezeptor der basalen Immunantwort, BAK1 als Interaktor für Remorin 6.4 gefunden. Zuletzt wurden einige wenige Remorine mit Hilfe von Mutantenlinien in einer genetischen Studie phänotypischen Analysen bezüglich ihrer Funktion bei Pflanzen-Pathogen Interaktionen unterzogen. Remorin 6.4 spielt hiernach eine Rolle bei der Immunantwort nach Befall mit virulenten Bakterien. Die grundlegende Erkenntnis, dass in lebenden Zellen zahlreiche klar unterscheidbare Arten an Membrandomänen koexistieren, ist ein Meilenstein auf dem Weg zur Anerkennung einer neuen Vorstellung vom Aufbau der Zytoplasmamembran. Diese wird häufig noch als undifferenzierte zweidimensionale Flüssigkeit beschrieben, in welcher stellenweise sogenannte Lipidflöße, festere Strukturen aus Cholesterin und Sphingolipiden, die auch bestimmte Proteine beherbergen können, auftreten. Anhand der in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse, sowie ähnlicher Studien in Hefe lässt sich nun folgendes Bild zeichnen: Es ist davon auszugehen, dass unterschiedliche Proteine, welche im selben biologischen Prozess involviert sind, in unmittelbarer Nachbarschaft oder sogar im selben Proteinkomplex in der Membran organisiert sind. Die Lipidzusammensetzung in der unmittelbaren Umgebung wird von diesen Proteinen bestimmt, bietet jedoch auch die Grundlage für die Bildung der Domäne, indem sie die Lokalisation der Komponenten in diesem Bereich fördert. Die zahlreichen an der Zellmembran gleichzeitig ablaufenden, unterschiedlichen Prozesse erfordern eine hochkomplexe, zeitlich und räumlich stark regulierte Kompartimentierung der Membran. Es kann vermutet werden, dass Remorine eine Rolle als Gerüstproteine bei der Ausbildung einer Auswahl dieser Domänen bilden. Im Fall von Remorin 6.4 ist das Protein für den Prozess der Flagellin-Erkennung und die unmittelbaren Abwehrantworten, welche nachweislich eine Präformierung der beteiligten Proteinkomplexe voraussetzen, notwendig.

In this dissertation project comparative morphological studies on the nervous system, mandible structure and sensory equipment of Decapoda and Peracarida are presented and interpreted with regard to the evolution of the taxa. This is a cumulative dissertation and the results were obtained in several separate publications. Both larval and adult characters as well as the ontogeny of certain features were included and analysed using various sets of imaging techniques ranging from conventional light microscopy to ultrastructure research with transmission electron microscopy. Attention was focused on the description and development of previously unexplored sets of characters which can be included in a reconstruction of crustacean phylogeny. The adult nervous system in Decapoda has been extensively studied for a long time and shows very specific taxon generic adaptations. In the present thesis now also the larval nervous system was comparatively investigated in its entirety for the first time. By use of computer assisted 3D reconstruction general and species specific features were analysed and basic elements were described, including the segmental ganglia and their neuropils as well as the segmental nerves. The larval nervous system is in a transitory stage to the adult organization, already showing well differentiated basic elements. Likewise the phase-specific structure reflects adaptations to larval life. The studied species respectively represent one of the three decapod main lineages, i.e. Caridea, Anomura and Brachyura. Against this background variations in the differentiation of 3certain ganglia can best be explained with shifts in the timing of morphogenetic events, i.e. heterochrony. The studies on heterochrony as motors of evolution are another core topic of this project. Along with the latter study also the morphology and finestructure of decapod mandibles during larval development was investigated, based on two closely related species, showing different feeding modes in the zoea I. Thus, it could be tested whether the mandible structure in early larval stages only depends on feeding modes or an evolutionary ground pattern is recognizable even in species with non-feeding zoea I. In case of a comparison of mandibles, restricted only to the features of the zoea I, adaptations to food preferences may obscure taxon- specific features. In detailed inspection, however, it could be shown that even in species with non- feeding zoea I apomorph basic features of the related taxon can be recognized. This supports the hypothesis of the presence of phylogenetic relevant character sets in larval mandible morphology. The monophyly of the Mandibulata is manly based on hypotheses defending the homology of the mandibles in Myriapoda, Hexapoda and Crustacea, nevertheless, knowledge on sensory structures located on the gnathal lobe is astonishingly limited, even less is known about their ultrastructure. The development of this complex of characteristics represents a further aim of this project. For this purpose the ultrastructure of the mandibular gnathal lobe of the zoea I of a rockpool prawn was analysed. Besides external structure and location and an analysis of the modality specific structures, special attention was paid to the features of the lacinia mobilis. In total a number of seven different types of sensilla, innervated by four different types of dendrites, could be described and compared, including (1) mechanoreceptive hair-sensilla and (2) putative contact-chemo-receptors, as well as (3) sensilla without external structures and (4) sensilla associated with inflexible spines. The results reveal new insights into the functional morphology of larval decapod mandibles and constitute a significant character complex including fine- and ultrastructural features. Following-up the character complex was completed by investigations of respective features of a peracarid representative. The results also present an overview of the sensory elements of the mandible as well as a detailed analysis of the lacinia mobilis based on their ultrastructure and features related to ecdysis. By comparison it can be shown, that the lacinia mobilis on the right mandible in Peracarida and also the respective structure in Decapoda are mechanosensitive sensilla. In conclusion the hypothesis of a possible homology of the latter structures gains further support. Concerning the structures on the left mandible a differentiated consideration is necessary. No unambiguous conclusions can be made and it remains to be resolved if the lacinia mobilis on the left mandible is a derived sensillum or a compound structure equipped with multiple sensilla. With the application of many different state-of-the-art technics and the overall discussion of the results an important contribution to eumalacostracan phylogeny, maybe even crustacean phylogeny, could be made. Character sets comprising different levels of organization of the arthropod body could be established. Primarily phylogenetic relevant signal in the basic elements of the larval nervous system and the mandibles in Decapoda could be presented. Furthermore, highly complex and detailed character sets of the mandible ultrastructure were developed, revealing a comprehensive presentation of the sensory capacities of eumalacostracan mandibles and by comparison already allowed conclusions about the homology of the lacinia mobilis. Thus, also the phylogenetic position of the respective taxa can be confirmed.