Experimentelle Untersuchungen zum retroviralen Gentransfer in primäre Chondrozyten des Kaninchens
Beschreibung
vor 20 Jahren
Knorpeldefekte lassen sich nicht zufriedenstellend therapieren, da
bis heute ein kontrollierter regenerativer Gewebeaufbau unmöglich
war. Eine neue Strategie wäre eine Kombination von
Chondrozytentransplantation mit gentherapeutischen Methoden, z. B.
die stabile Ex-vivo-Transduktion von primären Chondrozyten mit
retroviralen Vektoren, die gewebeaufbauende Zytokine exprimieren.
Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb Etablierung und
Optimierung des retoviralen Gentransfers in primäre
Kaninchenchondrozyten und die Beobachtung von Verbleib, Vitalität
und Genexpression der Zelltransplantate in vivo. Transduzierte
Zellen sollten ohne weitere Selektionsverfahren für eine spätere
Transplantation verwendet werden können. Da regulierbare
Genexpression in einem solchen Modell von Vorteil ist, war ein
weiteres Ziel die Entwicklung retroviraler Tet-On-Vektoren. Es
wurden konstitutiv exprimierende retrovirale Vektoren und
Tet-On-Vektoren kloniert und Retroviren mit unterschiedlichen
Infektionsspektren generiert. Effizienz und Stabilität des
Gentransfers wurden ohne weitere Selektionsverfahren mit Hilfe
konstitutiv nlslacZ-exprimierender retroviraler Vektoren in vitro
und in vivo beurteilt. Zusätzlich wurde stellvertretend für ein
therapeutisches Gen der Wachstumsfaktor hbmp-2 transferiert.
Retrovirale Ein-Vektor-Systeme, die den reversen Transaktivator
rtTA2s-M2 und den Tet-responsive Promotor enthielten, wurden in
vitro durch die Expression der Reportergene nlslacZ oder egfp in
verschiedenen Zelllinien getestet. Mit VSV.G-pseudotypisierten
Retroviren konnte eine Transduktionseffizienz von bis zu 99 %
erzielt werden, amphotrope Viren waren deutlich weniger effizient.
Transduzierte Chondrozyten zeigten in vitro über mindestens 12
Wochen eine stabile Transgenexpression, die auch in 3D-Kultur auf
Kollagenschwämmen fortbestand. In vivo war für mindestens drei
Wochen Transgenexpression nachweisbar. hbmp-2 transduzierte Zellen
exprimierten zudem dieses Transgen in vitro. Die neu entwickelten
Tetrazyklin-induzierbaren Retroviren zeigten eine starke
Basalexpression bei nur geringer Steigerung nach Induktion mit
Doxyzyklin. Die Transduktionseffizienz dieser Retroviren war
wesentlich geringer als bei der Verwendung konstitutiv
exprimierender Vektoren. VSV.G-pseudotypisierte Retroviren sind
eine optimale Methode für den retroviralen Gentransfer in primäre
Kaninchenchondrozyten ohne weitere Selektionsverfahren. Neben dem
Transfer von Markergenen ist dies die Grundlage für den Transfer
von therapeutischen Genen, um deren Effekt in vitro und in vivo zu
untersuchen. Zudem wurde ein neuartiger universal einsetzbarer
Vektor entwickelt, der die Klonierung in die retroviralen U3 Region
und somit die Konstruktion retroviraler Double-copy-Vektoren
erlaubt. Die Entwicklung zuverlässiger retroviraler Tet-On-Vektoren
bleibt weiterhin eine Herausforderung für die Zukunft.
bis heute ein kontrollierter regenerativer Gewebeaufbau unmöglich
war. Eine neue Strategie wäre eine Kombination von
Chondrozytentransplantation mit gentherapeutischen Methoden, z. B.
die stabile Ex-vivo-Transduktion von primären Chondrozyten mit
retroviralen Vektoren, die gewebeaufbauende Zytokine exprimieren.
Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb Etablierung und
Optimierung des retoviralen Gentransfers in primäre
Kaninchenchondrozyten und die Beobachtung von Verbleib, Vitalität
und Genexpression der Zelltransplantate in vivo. Transduzierte
Zellen sollten ohne weitere Selektionsverfahren für eine spätere
Transplantation verwendet werden können. Da regulierbare
Genexpression in einem solchen Modell von Vorteil ist, war ein
weiteres Ziel die Entwicklung retroviraler Tet-On-Vektoren. Es
wurden konstitutiv exprimierende retrovirale Vektoren und
Tet-On-Vektoren kloniert und Retroviren mit unterschiedlichen
Infektionsspektren generiert. Effizienz und Stabilität des
Gentransfers wurden ohne weitere Selektionsverfahren mit Hilfe
konstitutiv nlslacZ-exprimierender retroviraler Vektoren in vitro
und in vivo beurteilt. Zusätzlich wurde stellvertretend für ein
therapeutisches Gen der Wachstumsfaktor hbmp-2 transferiert.
Retrovirale Ein-Vektor-Systeme, die den reversen Transaktivator
rtTA2s-M2 und den Tet-responsive Promotor enthielten, wurden in
vitro durch die Expression der Reportergene nlslacZ oder egfp in
verschiedenen Zelllinien getestet. Mit VSV.G-pseudotypisierten
Retroviren konnte eine Transduktionseffizienz von bis zu 99 %
erzielt werden, amphotrope Viren waren deutlich weniger effizient.
Transduzierte Chondrozyten zeigten in vitro über mindestens 12
Wochen eine stabile Transgenexpression, die auch in 3D-Kultur auf
Kollagenschwämmen fortbestand. In vivo war für mindestens drei
Wochen Transgenexpression nachweisbar. hbmp-2 transduzierte Zellen
exprimierten zudem dieses Transgen in vitro. Die neu entwickelten
Tetrazyklin-induzierbaren Retroviren zeigten eine starke
Basalexpression bei nur geringer Steigerung nach Induktion mit
Doxyzyklin. Die Transduktionseffizienz dieser Retroviren war
wesentlich geringer als bei der Verwendung konstitutiv
exprimierender Vektoren. VSV.G-pseudotypisierte Retroviren sind
eine optimale Methode für den retroviralen Gentransfer in primäre
Kaninchenchondrozyten ohne weitere Selektionsverfahren. Neben dem
Transfer von Markergenen ist dies die Grundlage für den Transfer
von therapeutischen Genen, um deren Effekt in vitro und in vivo zu
untersuchen. Zudem wurde ein neuartiger universal einsetzbarer
Vektor entwickelt, der die Klonierung in die retroviralen U3 Region
und somit die Konstruktion retroviraler Double-copy-Vektoren
erlaubt. Die Entwicklung zuverlässiger retroviraler Tet-On-Vektoren
bleibt weiterhin eine Herausforderung für die Zukunft.
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