Entwicklung einer molekularbiologischen Methode zum Nachweis des Krebspesterregers Aphanomyces astaci SCHIKORA in nordamerikanischen Flusskrebsen (Pacifastacus leniusculus; Orconectes limosus; Procambarus clarkii)

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war den Krebspesterreger
Aphanomyces astaci, in den drei nordamerikanischen Flusskrebsarten
Signalkrebs (Pacifastacus leniusculus), Kamberkrebs (Orconectes
limosus) und Roter Amerikanischer Sumpfkrebs (Procambarus clarkii)
nachzuweisen. Diese Flusskrebsarten sind zwar gegen die Krebspest
resistent, können aber als latent infizierte Tiere Ausscheider des
Erregers sein und somit die für die Krebspest empfänglichen
Edelkrebse (Astacus astacus) infizieren. Bei dieser in Europa
heimischen Art geht die Erkrankung mit 100 % iger Mortalität
einher. Daher ist die Bestimmung des Träger-Status der
nordamerikanischen Krebse von großer Bedeutung um eine weitere
Verbreitung dieser hochinfektiösen Erkrankung in europäischen
Gewässern zu verhindern. Im Vergleich zu den Edelkrebsen konnten
bereits bei der makroskopischen und post sectionem bei der
mikroskopischen Betrachtung der nordamerikanischen Flusskrebse
Unterschiede festgestellt werden. Die letztgenannten weisen im
Bereich der weichen Abdominalkutikula sowie an den dünnen
Gelenkhäuten der Schreitbeine häufig Melanisierungen auf. Bei der
lichtmikroskopischen Untersuchung kann eine Wachstumshemmung der
Pilzhyphen durch Melanineinlagerungen beobachtet werden.
Unmittelbar nach der Invasion des Pilzes wird das Immunsystem
aktiviert und verhindert normalerweise einen Krankheitsausbruch.
Lediglich bei Einfluss von Stressoren kommt es zur Immunsuppression
nordamerikanischer Krebse und daraufhin nach dem Auftreten der für
die Krebspest typischen Symptome häufig zum Tod. Um mittels PCR
Aphanomyces astaci in den nordamerikanischen Krebsen nachzuweisen
musste zunächst die Pilz-DNA extrahiert werden. Dazu wurde das
DNeasy Tissue-Kit (Qiagen) verwendet. Es wurden unterschiedliche
Flusskrebsgewebe zur DNA-Extraktion eingesetzt um die am besten
geeignete Stelle zu finden. Die bereits bei Edelkrebsen verwendete
weiche Abdominalkutikula erwies sich auch bei den
nordamerikanischen Krebsen als äußerst zweckmäßig. Des weiteren
konnte bei DNA-Extraktionen aus den Beinansätzen, dem dorsalen
Abdomen und dem Telson der Erreger in der nachfolgenden PCR
nachgewiesen werden. Da die nordamerikanischen Flusskrebse aufgrund
ihres angepassten Immunsystems häufig nur sehr geringe Mengen an
Pilz-DNA aufweisen, stellt der Nachweis hier ein Problem dar. Bei
nur 50 mg eingesetzter Kutikula, laut Insekten-Protokoll des Tissue
Kits, ist unsicher ob gerade in diesem kleinen Gewebestück Pilz-DNA
vorhanden ist. Daher wurden auch Zusammenfassung
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132 Extraktionsversuche vorgenommen bei denen ein kompletter
Krebspanzer eines Kamberkrebses (3000 mg) zur DNA-Isolierung
eingesetzt wurde. Die benötigte Lysis-Puffermenge wurde
dementsprechend erhöht und die Inkubationszeit wurde verlängert.
Das Ergebnis der PCR war bei diesem Krebs positiv. Trotzdem wurde
beim Großteil der Kamberkrebse nur die weiche Kutikula in die
DNA-Extraktion eingesetzt. Hierfür wurden Kutikula-Segmente
ausgewählt, die bereits im Lichtmikroskop Melanisierungen oder
sogar Pilzhyphen aufwiesen. Bei zahlreichen Krebsen war das
Ergebnis der nachfolgenden PCR ebenfalls positiv. Zusammenfassend
wird somit deutlich, dass der molekularbiologische Nachweis des
Krebspesterreger Aphanomyces astaci auch bei nordamerikanischen
Flusskrebsen möglich ist. Sowohl die DNA-Extraktion als auch die
PCR, mit teilweise neu entwickelten Primern, können zur
Feststellung des „Carrier-Status“ eines nordamerikanischen Krebses
dienen.