Immunologisches Monitoring der Gentherapie des Fibrosarkoms der Katze

SUMMARY Immunological monitoring in the context of gene therapy of
feline fibrosarcomas Cytokine kinetics and humoral response to
vector and transgene In the context of an adenoviral gene therapy
of the fibrosarcoma of the cat we introduced the human interleukin
2 (huIL 2)-gene and the feline Interferon g (feIFN g)-gene, one or
the other or a combination of both. The aim of these studies is to
evaluate the toxic risk and the therapeutic potential of multiple
injections of two adenoviral vectors (type 5) expressing
immunostimulating genes as adjuvant therapy in cats with
spontaneous cancers. Several immunological parameters such as
cytokine concentration, antibodies of different classes against
vector and transgene and their neutralizing capacity were examined
in the thesis at hand in connexion with the questions of
adenoviruses in cats, pre-existing immunity and influence of
inflammatory context and way of application. The kinetic of the
production of IL 2 in different therapeutic approaches was
evaluated. A dose-dependency was shown. The levels found in the
group treated with a combination of both genes were lower than in
the group treated with just AdhuIL 2. Prospects of explications are
the shutdown of the viral CMV-Promoter due to the presence of
interferon, the rivalry of the two transgenes to transduce a cell
and the antiproliferative and antiviral effect of IFN g which
directly reduces vectors and infected cells and indirectly lowers
the IL 2-production by this means. More than that the application
mode played an important role: The plasmic cytokine concentration
was more than doubled after intratumoral injection compared to a
postoperative use to the tumour’s bed. The serum peak 24 hours
after vector application, which quickly redescended, is no decisive
factor for the course of cytokine concentration observed locally at
the tumor site. Literature shows rather a consistent local
secretion for a period of nine days with intensity ten times higher
than measured in blood circulation. There are indices that the
serum level of IL 2 the day after the first gene transfer may be
predictive for the appearance of recidivism within the first year.
The tendency of infected cells in?vitro to express more IL 2
without the presence of IFN g is the same. The possibility to dose
feIFN g per ELISA is presently not given. Furthermore the
development of anti-huIL 2-antibodies was surveyed for a period of
one year following the gene-carrying vector application. The
immunoglobulins appeared early in the group of treatment with IL 2
alone (day 30), and a tardily rise of Ig G was detected in the
therapeutic group with association to IFN g (day 90 to 180). By
measuring the existing antibodies capable to detect or to
neutralize as well the used adenovirus in ELISAs and biological
assays the influence of the transgene on the antiadenoviral immune
response could be proofed as well as the influence of the lieu of
administration in which the vector is applied. Antiviral Ig M
showed up day 14 and Ig G day 30, but their occurrence was much
higher in animals treated with interferon (solitary or in
association). The neutralizing capacity reached high percentages
even in elevated dilutions after just one week. Moreover the
immunological response to the vector depends on the application
mode in terms of considerably reduced neutralizing antibodies after
intratumoral injection compared to the postoperative inoculation to
the tumor-surrounding tissues. The parallel-lessened defence to the
transgene in this case may be assumed. Altogether the described
methods are convenient to ensure an immunological monitoring of
veterinary patients during an adenoviral gene therapy and to
document the reactions to the applied viral vector and the
expressed transgene. RESUME Surveillance immunologique du chat lors
de la thérapie génique du fibrosarcome félin Cinétique des
cytokines et réponse humorale contre vecteur et transgène Dans le
contexte d´une thérapie génique adenovirale du fibrosarcome du chat
nous avons introduit les gènes de l´interleukine 2 humaine (huIL 2)
ou de l´interféron g félin (feIFN g), seuls ou en combinaison. Le
but de ces études est d’évaluer le risque toxique et le potentiel
thérapeutique d´injections multiples de deux vecteurs adénoviraux
(type 5), contenant des gènes immunostimulateurs, comme thérapie
adjuvante dans des cancers spontanés des chats. Plusieurs
paramètres immunologiques comme la concentration des cytokines, des
anticorps de classes différentes contre le vecteur ou le transgène
et leur capacité de neutralisation ont été examinés dans la thèse
présentée en rapport avec la question d´adénovirus chez le chat
pour déterminer l’impact de l´immunité anti-adénovirale
préexistante, l´influence d´un contexte inflammatoire et le mode
d´administration. La cinétique de la production d´IL 2 dans
différentes approches thérapeutiques a été évaluée. Une relation
dose-réponse a été démontrée. Les niveaux trouvés dans le groupe
traité avec une combinaison de deux gènes étaient plus bas que dans
le groupe traité avec AdhuIL 2 seul. Ces résultats peuvent être
expliqués par la coupure du promoteur viral CMV due à la présence
de l´interféron dans le tissu, la compétition des deux vecteurs à
transgènes différents à transduire une cellule et l´effet
antiproliferatif et antiviral de l´IFN g qui limite la persistance
de l’infection et engendre de ce fait une baisse de la production
d´IL 2. De plus, le mode d´administration joue un rôle important:
La concentration de cytokines dans le sérum a plus que doublé après
une injection intratumorale, contrairement à une application
postopératoire dans le lit tumoral. Le pic de concentration de
cytokines dans le sérum, qui apparaît 24 heures après
l´administration du vecteur et qui disparaît très vite, n´est pas
un facteur décisif pour l’évolution de la concentration de cytokine
observée localement au site de la tumeur. La littérature montre
plutôt une sécrétion locale continue pour une période de neuf
jours, avec une intensité dix fois plus élevée que celle mesurée
dans la circulation sanguine. Certaines indications montrent que le
niveau d´IL 2 dans le sérum, un jour après le premier transfert
génétique, peut refléter les risques d’une récidive au cours de la
première année. KeywordsBitte tragen Sie hLa tendance des cellules
infectées in?vitro d´exprimer plus d´IL 2 sans la présence d´IFN g
est la même. La possibilité de doser feIFN g par ELISA n´est
actuellement pas donnée. En outre l´ apparition d´anticorps
anti-huIL 2 a été surveillée pendant un an, après administration du
vecteur porteur des gènes. Ces immunoglobulines se produisent tôt
dans le groupe de traitement avec l’IL 2 seul (jour 30), et une
hausse tardive des Ig G a été détectée dans le groupe thérapeutique
avec l´association d´IFN g (jour 90 à 180). En mesurant la quantité
d’anticorps capables de détecter ou de neutraliser même
l´adénovirus utilisé, par des tests d´ELISA et biologiques,
l´influence du transgène sur la réponse immunitaire
anti-adénovirale et aussi l´influence de l´endroit de l´application
dans lesquels les vecteurs sont injectés ont été démontrées. Les Ig
M antiviraux se manifestaient jour 14 et les Ig G jour 30, mais
étaient, en l´occurrence, beaucoup plus forte chez des animaux
traités avec l´interféron (seul ou en association). La capacité de
neutralisation atteint des pourcentages élevés à des dilutions
importantes après une semaine de traitement. De plus, la réponse
immunologique contre le vecteur dépend de la voie d´
administration: la quantité d’anticorps neutralisants est nettement
réduite après injection intratumorale, contrairement à une
inoculation postopératoire dans les tissus autour de la tumeur. La
défense contre le transgène peut être soupçonnée d´être diminuée en
parallèle. En tout, les méthodes décrites sont adéquates pour
garantir une surveillance immunologique des patients vétérinaires
lors d´une thérapie génique adénovirale et pour témoigner les
réactions au vecteur viral appliqué et au transgène exprimé.