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  3. Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19 Podcast
  4. Etablierung eines Expressions- und Testsystems für Membranrezeptoren an Oozyten von Xenopus laevis
Entwicklungsbiologen haben vor über 25 Jahren festgestellt, daß
Progesteron (PROG) die Fortsetzung der Reifeteilung an Xenopus
Oozyten durch nicht-genomische Mechanismen an der Plasmamembran
initiiert. Obwohl mehrere Publikationen dabei keine oder nur späte
Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration [Ca2+]i
beschreiben, konnten Wasserman et al. an einigen Oozyten
[Ca2+]i-Erhöhungen innerhalb der ersten Minute nach PROG-Zugabe
beobachten. Diese Versuche sollten mit der Methode des Calcium
Imaging reproduziert werden, wobei der Verlauf von [Ca2+]i durch
Fluoreszenzmessung und dem Ca2+-Indikatorfarbstoff Fura-2 gemessen
wurde. Dabei konnten innerhalb der ersten Minuten nach PROG-Zugabe
keine Veränderungen von [Ca2+]i gefunden werden.
Lysophosphatidylsäure (LPA) hingegen löste sehr zuverlässig
Calcium-Signale aus. Durch Thrombin, Angiotensin II und
Acetylcholin ausgelöste Effekte ließen sich, wenn auch seltener,
ebenfalls zeigen. Xenopus Oozyten sind molekularbiologisch als
eukaryontisches Expressionssystem nutzbar. Zur Etablierung des
Expressions- und Testsystems wurde RNA in die Oozyten injiziert,
die für den GnRH-Rezeptor kodiert. Nach erfolgreicher Expression
steigt [Ca2+]i 1-3 Minuten nach der Rezeptorbindung über eine
Aktivierung von Phospholipase Cb und das InsP3 System an. Auch bei
Injektion von weniger als 0,5ng RNA pro Oozyte in das Zytosol
konnte nach zwei Tagen, bei weniger als 0,15ng nach vier Tagen, ein
schnelles Ca2+-Signal auf GnRH-Zugabe gesehen werden. Ebenso
zeigten diese Effekte auch Oozyten, bei denen ein eukaryontischer
GnRH-Rezeptor-Expressionsvektor in den Kern mikroinjiziert wurde,
nicht aber unbehandelte Oozyten oder andere Negativkontrollen. An
glatten Gefäßmuskelzellen (RSMC) kann in vitro eine schnelle
Erhöhung von [Ca2+]i auf Aldosteron (ALDO) und an Spermatozoen auf
PROG gezeigt werden. Zur Anwendung des Expressionssystems auf
schnelle nicht-genomische Steroideffekte wurde einerseits aus
diesen Zellen isolierte RNA in den Oozyten exprimiert, als auch
RNA, welche für ein membranständiges Progesteron-bindendes Protein
(mPR) kodiert. Durch Expression von RSMC-RNA konnte an Oozyten
allerdings keine Calciumreaktion auf ALDO beobachtet werden;
ebensowenig auf PROG durch Expression von RNA aus Mäusehoden oder
mPR-RNA. Die hier vorgestellte Methode ist daher weniger geeignet
zur Screening-Untersuchung bei der Expressionsklonierung zur
Isolierung putativer Rezeptoren aus Genbanken oder Gesamt-RNA.
Insgesamt handelt es sich jedoch um ein sehr gutes System, die
Expression eines Rezeptors funktionell nachzuweisen; weitere
Untersuchungen zur Rezeptoraktivierung, Signaltransduktion und
topographischen Signalausbreitung lassen sich anschließen.

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