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  3. Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19 Podcast
  4. Herstellung von Insertions- und Deletionsmutanten des murinen Zytomegalievirus und deren Untersuchung in vitro und in vivo
Das humane Zytomegalievirus (HCMV) ist ein speziesspezifisches,
humanpathogenes Herpesvirus. Ein etabliertes System zur
Untersuchung der CMV-Infektion in vivo ist das murine
Zytomegalievirus (MCMV). Das 230 kb große Genom von MCMV liegt seit
kurzem als bakterielles artifizielles Chromosom (BAC) kloniert vor.
Damit eröffnen sich neue Strategien für gentechnologische
Untersuchungen, die Gegenstand dieser Dissertation sind: Mit
homologer Rekombination in E. coli und mit Transposonmutagenese
wurden Insertionsmutanten und Deletionsmutanten des MCMV
hergestellt und in NIH 3T3 Fibroblasten in vitro sowie BALB/c
Mäusen in vivo charakterisiert. Insertionsmutanten: Zwei
verschiedene sezernierbare und quantitativ nachweisbare Markergene
(HBsAg; SEAP) wurden jeweils so in das MCMV-Genom inseriert, dass
sie im Rahmen einer Infektion in vitro wie auch in vivo zur
Expression kommen. Im Versuchstier korrelierte die Menge der in das
Serum sezernierten Marker hochgradig mit mit den Virustitern in
Milz und Leber. Die Markersekrtetion wurde mit einer hierfür neu
etablierten quantitativen PCR-Methode (TaqMan) bezüglich der
Sensitivität verglichen. Bei immunkompetenten Mäusen war SEAP – vor
der PCR und der Virusbestimmung - das empfindlichste
Nachweisverfahren. Die entwickelten Methoden erlauben erstmals die
longitudinale Beobachtung einer MCMV-Infektion in ein- und-
demselben Versuchstier. Deletionsmutanten: Das Wachstumsverhalten
von 576 MCMV-Transposon-Mutanten in Fibroblasten wurde analysiert.
Identifiziert wurden 19 Mutanten mit wachstumsdefizitären
Phänotypen, denen Veränderungen von sechs offenen Leserahmen (ORF)
zugrunde lagen. Eine Trunkierung eines dieser bisher nicht näher
definierten, offensichtlich nicht essentielle Gene, bewirkt ein
signifikantes, quantifizierbares Wachstumsdefizit. Mit Hilfe von
elektronen-mikroskopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass
bei MCMV die Destruktion des Leserahmens M76 ein Exportdefizit aus
dem Zellkern zur Folge hat.

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