Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06 Archiv

So far, much attention has been paid to regulation of transcription. However, it has been realized that controlled mRNA decay is an equally important process. To understand the contributions of mRNA synthesis and mRNA degradation to gene regulation, we developed Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). DTA allows to monitor these contributions for both processes and for all mRNAs in the cell without perturbation of the cellular system. DTA works by non-perturbing metabolic RNA labeling that supersedes conventional methods for mRNA turnover analysis. It is accomplished with dynamic kinetic modeling to derive the gene-specific synthesis and decay parameters. DTA reveals that most mRNA synthesis rates result in several transcripts per cell and cell cycle, and most mRNA half-lives range around a median of 11 min. DTA can monitor the cellular response to osmotic stress with higher sensitivity and temporal resolution than standard transcriptomics. In contrast to monotonically increasing total mRNA levels, DTA reveals three phases of the stress response. In the initial shock phase, mRNA synthesis and decay rates decrease globally, resulting in mRNA storage. During the subsequent induction phase, both rates increase for a subset of genes, resulting in production and rapid removal of stress-responsive mRNAs. In the following recovery phase, decay rates are largely restored, whereas synthesis rates remain altered, apparently enabling growth at high salt concentration. Stress-induced changes in mRNA synthesis rates are predicted from gene occupancy with RNA polymerase II. Thus, DTA realistically monitors the dynamics in mRNA metabolism that underlie gene regulatory systems. One of the technical obstacles of standard transcriptomics is the unknown normalization factor between samples, i.e. wild-type and mutant cells. Variations in RNA extraction efficiencies, amplification steps and scanner calibration introduce differences in the global intensity levels. The required normalization limits the precision of DTA. We have extended DTA to comparative DTA (cDTA), to eliminate this obstacle. cDTA provides absolute rates of mRNA synthesis and decay in Saccharomyces cerevisiae (Sc) cells with the use of Schizosaccharomyces pombe (Sp) as an internal standard. It therefore allows for direct comparison of RNA synthesis and decay rates between samples. cDTA reveals that Sc and Sp transcripts that encode orthologous proteins have similar synthesis rates, whereas decay rates are five fold lower in Sp, resulting in similar mRNA concentrations despite the larger Sp cell volume. cDTA of Sc mutants reveals that a eukaryote can buffer mRNA levels. Impairing transcription with a point mutation in RNA polymerase (Pol) II causes decreased mRNA synthesis rates as expected, but also decreased decay rates. Impairing mRNA degradation by deleting deadenylase subunits of the Ccr4–Not complex causes decreased decay rates as expected, but also decreased synthesis rates. In this thesis, we provide a novel tool to estimate RNA synthesis and decay rates: a quantitative dynamic model to describe mRNA metabolism in growing cells to complement the biochemical protocol of DTA/cDTA. It can be applied to reveal rate changes for all kinds of perturbations, e.g. in knock-out or point mutation strains, in responses to stress stimuli or in small molecule interfering assays like treatments with miRNA or siRNA inhibitors. In doing so, we show that DTA is a valuable tool for miRNA target validation. The DTA/cDTA approach is in principle applicable to virtually every organism. The bioinformatic workflow of DTA/cDTA is implemented in the open source R/Bioconductor package DTA.

Dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis is a hallmark of complex and multifactorial psychiatric diseases such as anxiety and mood disorders. The 41-amino acid neuropeptide Corticotropin Releasing Hormone (CRH) is a major regulator of the mammalian stress response. Upon stressful stimuli, it binds to the Corticotropin Releasing Hormone Receptor 1 (CRHR1), a typical member of the class B GPCRs and a potential novel target for the therapeutic intervention in major depressive disorder. A precise understanding of the peptide-receptor interactions is an essential prerequisite towards the development of efficient CRHR1 specific antagonists. To chemically probe the molecular interaction of CRH with its cognate receptor, a high-throughput conjugation approach which mimics the natural activation mechanism for class B GPCRs was developed. Acetylene-tagged peptide libraries were synthesized and conjugated to high-affinity azide-modified carrier peptides using copper-catalyzed dipolar cycloaddition. The resulting conjugates reconstitute potent ligands and were tested in situ for modulation of the CRHR1 activity in a cell-based assay. This approach allows to (i) define the sequence motifs which are required for receptor activation or inhibition, (ii) identify the critical functional groups and investigate structure-activity-relationships, and (iii) develop novel optimized, highly potent peptide probes which are specific for the transmembrane domain of the receptor. The membrane recruitment by a high-affinity carrier peptide enhances the potency of tethered peptides and allows the initial testing of weak fragments that otherwise would be inactive. The biomimetic screening led to the discovery of transtressin, a highly modified and potent CRHR1 transmembrane domain-specific optimized agonist (EC50 = 4 nM). Beyond its intrinsic agonistic activity, transtressin is an essential tool for the pharmacological characterization of CRHR1 antagonists in competition assays.

Loline is the eponymous member of an alkaloid family, originally isolated in 1892 from tall fescue grasses, but later found in many other plant families. They are produced by endophytic fungi and are as toxic to insects as nicotine, thereby protecting the host plant from herbivores, but many aspects of their chemical ecology are not yet understood. Despite its long history and intriguing biological activity, there has been only one successful asymmetric synthesis of loline to date, which required 20 steps. This may be due to its strained, heterotricyclic molecular skeleton, that incorporates polar functionalities in close proximity, thus rendering the loline alkaloids more challenging targets than they may appear at first sight. This dissertation deals with different approaches for the synthesis of loline alkaloids and reports interesting outcomes. The synthesis, which finally led to success is efficient and asymmetric and requires only 10 steps. The synthesis is scalable, diversifiable, gives access to all loline alkaloids and has served to provide several research groups sufficient material to investigate the interesting chemical ecology of these alkaloids. The naphthomycins are a class of ansamycin antibiotics that contain a macrocycle of polyketide origin with an amide linkage to a naphthalenic moiety. To date, 11 different naphthomycins (naphthomycin A–K) have been isolated and structurally elucidated. In spite of their unique structure and broad spectrum of biological activities, none of the naphthomycins have been synthesized to date. This dissertation includes the syntheses of two building blocks from inexpensive commercially available starting materials in 9 steps each and their coupling in a Horner-Wadsworth-Emmons reaction (HWE) and further transformation to give the C6-C23 fragment of all naphthomycins. In addition, a naphthoquinone precursor has been synthesized starting from a literature known quinone and a novel Danishefsky-type diene. The synthesis of the novel Danishefsky-type diene and its reactivity in Diels-Alder reactions is reported.

Eine kritische Vorraussetzung für eine effektive Krebstherapie stellt die Identifizierung von Tumor-spezifischen oder Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) dar. Diese Antigene sollten Peptidsequenzen besitzen, die an MHC-Moleküle binden. Auch sollten diese von Tumorzellen prozessiert und auf MHC-Molekülen präsentiert werden. Ein weiteres TAA-Kriterium stellt die Überexpression im Tumor dar, was eine Erkennung durch T-Zellen ermöglicht und folglich eine Tumor-spezifische Immunantwort nach sich ziehen soll. Bei der B-chronischen lymphatischen Leukämie (B-CLL) wurden bislang nur wenige Tumorantigene identifiziert, die als potentielle Zielstrukturen für eine Generierung einer spezifischen T-Zellantwort in Frage kommen. Daher sind die Bestrebungen groß, neue B CLL-assoziierte Antigene zu identifizieren. In dieser Arbeit wurden die Moleküle hTERT, CD23 und CD229 hinsichtlich ihrer Möglichkeiten untersucht, als TAAs bei der B-CLL zu fungieren. Die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase Reverse Transkripase (hTERT), stellt ein universelles Tumorantigen dar, das in einer Vielzahl verschiedener Krebstypen, einschließlich hämatopoetischer Erkrankungen, exprimiert wird, jedoch nicht oder nur in geringem Maße bei adulten, gesunden, differenzierten Zellen detektierbar ist. Der humane Niedrig-Affinitätsrezeptor für IgE, auch bekannt als CD23, ist auf verschiedenen hämatopoetischen Zellen zu finden. Bei der B-CLL wird CD23 konstitutiv exprimiert und atypisch auf den malignen B-Zellen reguliert im Vergleich zu normalen B-Lymphozyten. Dies hat eine starke Überexpression des Moleküls zur Folge. Das Humane Ly9 oder CD229, das Homolog zum murinen Ly9, ist ein Mitglied der SLAM- (signaling lymphocyte activation molecule) Familie, die Singnalrezeptoren repräsentieren. CD229 interagiert mit Antigen-spezifischen Rezeptoren und vermittelt so die Zelladhäsion zwischen Lymphozyten und anderen Zellen. Die Überexpression von CD229 auf hämatopoetischen Zellen wurde in einer Publikation beschrieben, die gezeigt hat, dass 12/15 B-CLL Patienten positiv für das Molekül waren. Ein Merkmal eines Tumorantigens/TAAs stellt die Überexpression in einem Tumor im Vergleich zum Normalgewebe dar. Alle drei Antigene wurden bezüglich ihres Expressionsprofils untersucht, und es konnte eine eindeutige Überexpression verglichen mit normalen Zellen nachgewiesen werden (RT-PCR, FACS-Analysen). Die Immunogenität und MHC-Restriktion (hier HLA-A0201) der ausgewählten Peptide wurde mit Hilfe in vitro generierter zytotoxischer T-Zellen (CTLs) von gesunden Spendern gezeigt, die Antigen-spezifisch durch Stimulation mit autologen, Peptid-beladenen Dendritischen Zellen (DCs) expandiert wurden. Die endogene Prozessierung und Präsentation der potentiellen Tumorantigene, genauer der verschiedenen hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide, konnte mit Hilfe Antigen-spezifischer CTLs von gesunden Spendern nachgewiesen werden, da diese spezifisch die HLA-A0201+ B-Zell-abstammende Zelllinie Ramos, HLA-A0201+ naive B-CLL Zellen und Peptid-beladene T2-Zellen in MHC-I-restringierter Weise erkannten (IFN-γ-ELISPOT Assays, [Cr51]-release Assay). Diese Experimente lassen auf eine natürliche Prozessierung und Präsentation der hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide via HLA-A0201 auf den B-CLL Zellen schließen. Des Weiteren konnten autologe hTERT-, CD23- and CD229-spezifische T-Zellen von B-CLL Patienten in Gegenwart von autologen CD40L-aktivierten B CLL Zellen und interessanterweise auch durch autologe, naive, maligne B-Zellen expandiert werden, die einen deutlichen Anti-leukämischen Effekt zeigten (IFN-γ-ELISPOT Assays, Dimerfärbungen). Ein möglicher Grund für die Generierung einer T-Zellantwort mit autologen naiven B-CLL Zellen als Stimulatoren scheinen das von den B-CLL Zellen vermittelte Mikromilieu (Zytokinprofil) darzustellen. Anhand der Quantität und Qualität der erzielten CTL-Reaktivitäten gegen die drei unterschiedlichen Moleküle zeigte sich, dass vor allem die Oberflächenmoleküle CD229 und CD23 als neue TAAs bei der B-CLL geeignet scheinen. hTERT ist ebenfalls in der Lage, eine Antigen-spezifische T-Zellreaktion zu induzieren, jedoch mit geringerer Effizienz. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass CD229 und CD23 natürlich prozessiert und als TAAs bei der B-CLL präsentiert werden, die die Expansion autologer Tumor-spezifischer T-Zellen erlauben. Daher stellen sie geeignete Zielstrukturen für T-Zellbasierte, immuntherapeutische Strategien und ein Immunmonitoring bei dieser hämatologischen Erkrankung dar. Für hTERT gilt dies jedoch nur bedingt.