Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06 Archiv

Most of the disulfuric acids like thiosulfuric acid (H2S2O3), dithionous acid (H2S2O4), disulfurous acid, (H2S2O5), dithionic acid (H2S2O6), disulfuric acid (H2S2O7) and peroxydisulfuric acid (H2S2O8) have never been obtained as pure compounds, because they are not stable at ambient temperatures. Therefore no experimental evidences are known for their structures. In this thesis, the synthesis and spectroscopical characterization of the disulfuric acids H2S2Ox (x = 3,4,6,8) is presented. The compounds were obtained by the reaction of dry Na2S2Ox or K2S2Ox with anhydrous HF at −60 °C. The protonated species H3S2Oy+MF6− (y = 3 - 8) were synthesized and characterized using the superacidic systems HF/MF5 (M = As, Sb). The protonation of sulfuric acid, (H3SO4+)n(GeF5−)n, with the new superacidic system HF/GeF4 is presented and gives evidence for the acid strength of this system. Moreover, the first single crystal structure of protonated dimethylsulfoxide (DMSO), [(CH3)2SOH+]4[Ge3F16]4− is discussed. The protonated forms of the aminosulfonic acids NH3SO3, NH3CH2SO3, NH3C2H4SO3 and methanesulfonamide (CH3SO2NH2) are described. In this context, the first crystal structure of protonated taurine, NH3C2H4SO3H+SbF6− is discussed.

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) haben in den vergangenen Jahren auf-grund ihres potenziellen Einsatzes in der regenerativen Medizin sowie in der Prävention und Behandlung diverser Krankheiten ein großes wissenschaftliches Interesse geweckt. Einen wichtigen Aspekt stellt in diesem Zusammenhang die Regulation von Stammzell-funktionen durch Signalwege wie beispielsweise den Wnt/β-Catenin-Signaltransduk-tionsweg dar. Während am Signalweg beteiligte Komponenten und Teilfunktionen bereits beschrieben sind, existieren bezüglich der Initiation der Signaltransduktion an der Zelloberfläche auf Rezeptorebene lediglich rudimentäre Kenntnisse. Vor diesem Hintergrund wurde in dieser Arbeit die molekulare Funktion der Wnt-Ko-rezeptoren LRP5 und LRP6 (low-density lipoprotein receptor-related protein) im Wnt/β-Catenin-Signalweg von hMSC genauer untersucht. Für die spezifische Quantifizierung β-Catenin-abhängiger Transkriptionsprozesse wurde zunächst ein TCF/LEF-Reportergen-System in hMSC etabliert. In diesem System erfolgt die Expression des Reporterproteins erst nach Translokation von β-Catenin in den Zellkern und dessen Assoziation mit Transkriptionsfaktoren der TCF/LEF-Familie. Im Vergleich mit dem konventionellen TOP/FOP-Flash-Reportergen-System zeigte das TCF/LEF-Reportergen-System eine deutlich höhere Sensitivität. Mittels vergleichender Studien zur molekularen Funktion von LRP5 und LRP6, die neben der RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Technologie auch Überexpressionsstudien und Rescue-Experimente beinhalteten, konnte eindeutig gezeigt werden, dass LRP6 eine entscheidende Rolle in der β-Catenin-vermittelten Signaltransduktion von hMSC übernimmt. Nach Applikation von Wnt-3a führte RNAi gegen LRP6 zu einer starken Ab-nahme der Wnt/β-Catenin-Signaltransduktion, wohingegen der Knockdown von LRP5 keine Veränderung zeigte. In einem umgekehrten Ansatz resultierte die Überexpression von LRP6 in einer starken Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Weges, während die Über-expression von LRP5 keinen nachhaltigen Einfluss zeigte. Darüber hinaus führte in LRP6 -Knockdown-hMSC die Überexpression von LRP6 – jedoch nicht die von LRP5 – zur Rekonstitution der Wnt-3a-induzierten, β-Catenin-vermittelten Signaltransduktion. Diese Daten weisen LRP6 als den Hauptrezeptor für die Wnt-3a/β-Catenin-vermittelte Signaltransduktion in hMSC aus, wobei diese Funktion nicht durch LRP5 ersetzt werden kann. Da der Wnt/β-Catenin-Signalweg eng mit Differenzierungsprozessen assoziiert ist, wurde in diesem Kontext die Bedeutung der Wnt-Korezeptoren in hMSC evaluiert. Nach Knockdown von LRP6 war eine Differenzierung in die adipogene Richtung zu beobachten, die mit der Bildung fettähnlicher Vakuolen und einer erhöhten Expression des Transkriptionsfaktors PPAR-γ (Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor-γ) assoziiert war. Unter dem Einsatz adipogener Zusätze konnte die Differenzierung von LRP6-Knockdown-hMSC in fettähnliche Zellen weiter verstärkt werden, was mit einer deutlich gesteigerten Akkumulation von Fettvakuolen sowie einer weiteren Erhöhung der PPAR-γ Expression einherging. Interessanterweise resultierte die Überexpression von LRP6 in diesen fettähnlichen Zellen in einer Zunahme der Wnt/β-Catenin-Signaltransduktion mit einer gleichzeitigen Abnahme der Expression von PPAR-γ. Zusammenfassend zeigen diese Erkenntnisse, dass LRP6 nicht nur in der Wnt-3a-induzierten, β-Catenin-vermittelten Signaltransduktion von hMSC eine tragende Rolle spielt, sondern auch für die Suppression der Differenzierung von hMSC in die adipogene Linie und damit für die Aufrechterhaltung des Stammzellcharakters entscheidend ist. Somit stellt der Wnt-Korezeptor LRP6 ein vielversprechendes Ziel zur therapeutischen Manipulation von hMSC in zukünftigen klinischen Anwendungen, wie z.B. der regenerativen und präventiven Medizin, dar.

Molecular chaperones of the Hsp70 class are essential for a number of cellular processes. The yeast mitochondrial Hsp70 chaperone Ssc1 plays an indispensable role for the mitochondrial biogenesis. As an essential component of the import motor of the TIM23 transolcase, Ssc1 drives the ATP-dependent translocation of proteins into the mitochondrial matrix. Moreover, it mediates the de novo folding and the assembly of several proteins in the mitochondrial matrix and prevents the formation of protein aggregates. Surprisingly, Ssc1 itself has a propensity to self-aggregate. Thus, it requires a helper protein, the chaperone Hep1 that prevents Ssc1 aggregation and maintains its structure and function. The mechanism of the protective function of Hep1 on Ssc1, however, is not understood. In the present study, the structural determinants of Ssc1 that make it prone to aggregation and the structural requirements of Ssc1 for its interaction with Hep1 were analysed and provided insights into the mechanism of prevention of Ssc1 aggregation by Hep1. The aggregation studies demonstrate that a variant of Ssc1 consisting of the ATPase domain and the subsequent interdomain linker aggregates in absence of Hep1. In contrast, the PBD and the ATPase domain alone are not prone to aggregation. Moreover, the interaction studies reveal that the aggregation-prone region seems to be the smallest entity within Ssc1 required for the interaction with Hep1. Taken together, the native Ssc1 adopts an aggregation-prone conformation, in which the ATPase domain with the interdomain linker has the propensity to aggregate. Hep1 binds to this aggregation-prone region and thereby counteracts the aggregation process and keeps the native Ssc1 in a functional and active state. Although Hsp70 chaperones are important for the biogenesis of a multitude of proteins, little is known about the biogenesis of these chaperones themselves. The present study reports on the analysis of the folding process of the mitochondrial Hsp70 chaperone Ssc1. In organello, in vivo and in vitro assays were established and then employed to study the de novo folding of Ssc1. Upon import into mitochondria, Ssc1 folds rapidly with the ATPase domain and the PBD adopting their structures independently of each other. Notably, the ATPase domain requires the presence of the interdomain linker for its folding, whereas the PBD folds without the linker. Moreover, in the absence of Hep1, the ATPase domain with the interdomain linker displays a severe folding defect, which indicates a role of Hep1 in the folding process of Ssc1. Apart from Hep1, none of the general mitochondrial chaperone systems seem to be important for the folding of Ssc1. Furthermore, the folding process of Ssc1 was reconstituted in vitro and the main steps of the folding pathway of Ssc1 were characterised. Hep1 and ATP/ADP are required and sufficient for the folding of Ssc1 into the native, catalytically active form. In an early step of folding, Hep1 interacts with the folding intermediate of Ssc1. This interaction induces conformational changes which allow binding of ATP/ADP. The binding of a nucleotide triggers Hep1 release and further folding of the intermediate into a native Ssc1. The present study provides the first direct evidence for the requirement of Hep1 for the folding of the Ssc1 chaperone. Thus, it demonstrates for the first time that the de novo folding of an Hsp70 chaperone depends on a specialized proteinaceous factor. In conclusion, Hep1 fulfils a dual chaperone function in the cell. It mediates the de novo folding of Ssc1 and maintains folded Ssc1 in a functional state during the ATPase cycle. Therefore, the Hep1 chaperone plays a crucial role for the protein biogenesis and homeostasis in mitochondria.

Cascade reactions are powerful synthetic methods, which can be used to introduce several C-C bonds and chiral centers in only one step. This thesis deals with synthetic studies toward polyketide type I and type II natural products as well as alkaloids, which are based on cascade key steps. In the case of polyketide natural products A-74528 and divergolides C and D, synthetic key steps inspired by proposed biomimetic aldol and Michael cascade reactions were approached. The work towards stephadiamine, a norhasubanan alkaloid, was focused on the incorporation of homoconjugated addition/Mannich cascade reaction. In addition, a radical cyclization step, which is presumably incorporated in the biogenesis of ansalactam A, was investigated.