Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 13/19 Archiv

Ungefähr die Hälfte aller Lymphomerkrankungen sind der Gruppe der indolenten Lymphome zuzuordnen. In dieser Deutschland weiten, retrospektiven, bevölkerungsbasierten Studie wurden repräsentative hämato-onkologische Behandlungszentren bezüglich ihrer diagnostischen und therapeutischen Strategien in der Behandlung indolenter Lymphome befragt um einen Überblick über die verwendenten diagnostischen und therapeutischen Verfahrensweisen und somit über die Therapierealität in Deutschland Ende 2006 zu erhalten und mit den aktuell gültigen Standards zu vergleichen. Dabei ist es bemerkenswert, dass die Patienten in dieser Untersuchung älter und in einem schlechteren Allgemeinzustandes waren als die Patientenkollektive der großen Phase III-Studien zur Therapieoptimierung indolenter Lymphome. In diesem Zusammenhang wirft der geringe Anteil an Patienten in klinischen Studien, die Frage auf, ob ältere Patienten und Patienten mit schlechterem Allgemeinzustand und/oder Begleiterkrankungen in diesen Studien unterrepräsentiert sind und dementsprechend die Studiendaten für dieses Patientenkollektiv nicht aussagekräftig sind. Genau für diese bei den indolenten Lymphomen große Patientengruppe werden daher spezielle Studien benötigt, um eine Fehlinterpretation der momentanen Datenlage zu vermeiden. Auffällig bei der Analyse der Daten sind die deutlich unterschiedlichen Therapiezielen in den behandelten Entitäten. Die behandelnden Ärzte scheinen im Gegensatz zur CLL nodale und Mantelzelllymphome für häufig heilbare Erkrankungen zu halten. Trotz der Tatsache, dass die meisten Patienten in fortgeschrittenem Stadium diagnostiziert wurden, für die es bis auf die allogene Transplantation bis heute keine eindeutig kurative Behandlungsoption gibt, waren die behandelnden Ärzte in 35% der Behandlungsfälle der Meinung, kurativ zu therapieren. Trotz der großen Bandbreite an unterschiedlichen Institutionen wurde die Erstlinien-Therapie in Deutschland vergleichsweise einheitlich durchgeführt. Die kombinierte Immunochemotherapie war die am meisten verwendete Therapiemodalität bei nodalen indolenten Lymphomen und Mantelzelllymphomen. Bei der CLL wurde Rituximab Ende 2006 noch zögerlich verwendet. Es wird interessant sein, ob die Daten der CLL-8 und der REACH-Studie in der Zwischenzeit zu einem Umdenken geführt haben. Gleiches gilt für die Daten der StiL-Studiengruppe zum Bendamustin, welches 2006 in der Erstlinien-Therapie nur vereinzelt angewendet wurde. Die Ansprechraten in der Erstlinien-Behandlung lagen im Gesamtkollektiv bei 83% (nodale indolente Lymphome 97%, CLL 74%, MCL 95%) mit 43% kompletten Remissionen. Im ersten Rezidiv lag die Gesamtansprechrate immer noch bei 76%. Interessanterweise erreichten die universitären Einrichtungen die besten Therapieergebnisse sowohl in der Erstlinientherapie als auch im Rezidiv, allerdings war das Patientenkollektiv der universitären Einrichtungen tendenziell jünger und wies weniger Risikofaktoren in Hinsicht auf den FLIPI-Index auf. Da die Beteiligung an klinischen Studien in den Universitätskliniken häufiger war als an den anderen Einrichtungen, lässt sich auch hier ein Selektions-Bias erkennen, der die Forderung nach großen Therapieoptimierungsstudien speziell für das Patientenkollektiv der onkologischen Praxen, untermauert.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die prinzipielle Fragestellung zu beantworten, ob Stammzellen aus humanen Haarfollikeln in ausreichender Menge expandiert werden können und inwieweit eine Differenzierung in neuroendokrine Zellen möglich ist. Es sollte eine Methode zur Isolierung und Langzeitkultivierung von Haarfollikelstammzellen etabliert und optimiert werden, um eine neue Quelle autologer adulter Stammzellen für zelltherapeutische Ansätze zu gewinnen. Durch Verwendung verschiedener Medien und Beschichtungsarten wurde ein Protokoll entwickelt, aus Dispase-verdauten Hautbiopsien Progenitorzellen zu isolieren. Die auf diese Weise expandierten Zellen wurden mit FACS-Analyse, RT-PCR und Immunhistologie charakterisiert. Im letzten Teil der Arbeit wurde durch Zugabe von spezifischen Faktoren die Fähigkeit zur Differenzierung in unterschiedliche Zelltypen untersucht. Nach Austestung verschiedener Zellkulturbedingungen wurde eine neue Population von Zellen aus der Haarfollikelregion isoliert. Diese Zellen, die als hBSCs bezeichnet wurden, waren über mehr als 30 Passagen mit stabilem Phänotyp kultivierbar (Self-Renewal). Zudem waren sie im Colony-Unit-Assay positiv und zeigten die Expression pluripotenter (Oct4) und multipotenter Stammzellmarker (Nestin, BCRP1, Sox2). Die molekulare Signatur der hBSCs zeigt einige Übereinstimmung mit Merkelzellen, neuroektodermalen Zellen der Haut, die eine Rolle als Mechanorezeptoren und neurosekretorische Zellen der Haut spielen. Unter Verwendung von etablierten Protokollen wurde die Fähigkeit der Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten, glatte Muskelzellen, Neuronen und endokrine Zellen untersucht. Der Nachweis der Entwicklung von glatten Muskelzellen, Neuronen und in eingeschränktem Maße auch Adipozyten belegt die Multipotenz der hBSCs. Darüber hinaus besitzen die hBSCs die Fähigkeit, stimulusabhängig Somatostatin zu exprimieren und zu sezernieren. Somit ist es erstmals gelungen, humane adulte Stammzellen/Progenitorzellen mit neuroendokrinen Eigenschaften zu isolieren. Zusammenfassend ist es in der vorliegenden Arbeit gelungen, eine Methode zu etablieren, mittels derer eine neue Population von humanen multipotenten Stammzellen aus der Haarfollikelregion in Langzeitkultur expandiert werden konnte. Die Plastizität der hBSCs und insbesondere die Differenzierung in reife endokrine Zellen muss in weiteren Studien untersucht werden.

Das Medulloblastom ist der häufigste maligne Hirntumor des Kindesalters, und die Entwicklung von zielgerichteten, nebenwirkungsarmen Therapiestrategien hat oberste Priorität. Die molekularen Mechanismen der malignen Transformation dieses Tumors sind noch nicht bis ins Letzte verstanden, jedoch ist bekannt, dass Medulloblastome von Körnerzellvorläufern abstammen können. Barhl1 ist einer der Transkriptionsfaktoren, die das Überleben und die Migration von Körnerzellvorläufern steuern, jedoch ist die Funktion, die Barhl1 im Medulloblastom hat, noch unbekannt. Diese Arbeit zeigt, dass die Expression von BARHL1 während der Entwicklungsphase des menschlichen Kleinhirns und in humanen Medulloblastomen im Vergleich zu Kleinhirnen von Erwachsenen signifikant hochreguliert ist. Hohe Barhl1 Expressionslevel wurden zudem in Medulloblastomen von Math1-cre:SmoM2Fl/+ Mäusen gefunden, welche ein bewährtes Mausmodel für Sonic hedgehog-assoziierte Medulloblastome darstellen, die von cerebellären Körnerzellvorläufern abstammen. Um die Funktion von Barhl1 in vivo während der Entwicklung und des Wachstums von Medulloblastomen zu untersuchen, wurden Barhl1-/- Math1-cre:SmoM2Fl/+ und Barhl1+/-Math1-cre:SmoM2Fl/+ Mäuse generiert. Interessanterweise zeigten Tumoren, die in diesen Mäusen entstanden, eine vermehrte mitotische Aktivität und eine verminderte neuronale Differenzierung. Zudem war das Überleben dieser Mäuse im Vergleich zu dem von Math1-cre:SmoM2Fl/+ Mäusen signifikant verkürzt. Im Einklang mit diesen Ergebnissen zeigten Patienten, deren Medulloblastom eine niedrige BARHL1 Expression aufwies, eine schlechtere Prognose als Patienten, deren Tumoren eine höhere BARHL1 Expression aufwiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Expression von Barhl1 das Tumorwachstum in murinen und humanen Medulloblastomen verlangsamt. Deswegen sollte BARHL1 im Hinblick auf potentielle Anwendungen für individualisierte therapeutische Strategien weiter untersucht werden.

Die Transplantation solider Organe hat einen festen Platz in der heutigen Medizin. Trotz der bereits erstaunlichen Ergebnisse nach Organtransplantationen bleibt der Wermutstropfen der lebenslangen, nebenwirkungsreichen immunsuppressiven Therapie. Ein Fortschritt kann mittels neuartiger Kon­zepte verwirklicht werden, die nicht wie bisher eine generelle Immunsuppression zur Folge haben, sondern die gezielte Toleranz des Spendermaterials durch den Empfänger bewirken, ohne ansonsten wesentlich auf die Funktion des Immunsystems einzuwirken. Ein vielversprechender Ansatz ist die mögliche Induktion einer transplantatspezifischen Toleranz durch zusätzliche Transplantation von mesenchymalen Stammzellen des Organspenders. Hierbei gilt es noch zahlreiche Probleme zu bewältigen. Beispielsweise werden Transplantate trotz vorheriger Gabe von Stammzellen des Organspenders abgestoßen. Um eine mögliche Ursache dieser komplexen Vorgänge zu finden, erfolgte in dieser Arbeit die Be­stimmung des Interleukin- 2 Spiegels nach Organtransplantation und Stammzelltransplantation im Mausmodell. Im Rahmen des Nichterreichens einer Toleranzinduktion finden sich hohe Interleukin- 2 Spiegel, die dafür verantwortlich zu machen sind, dass eine Immunantwort des Organempfängers die tole­ranzinduzierende Wirkung der zuvor durchgeführten Stammzelltransplantation im Keim erstickt.

The severe acute respiratory syndrome (SARS) was first observed in the Chinese province Guangdong in November 2002. The disease quickly spread around the globe via air travelling and caused a worldwide epidemic. Several research institutions together with the World Health Organisation (WHO) identified the SARS-coronavirus (SARS-CoV) as the causative agent of this disease. During the epidemic, about 8,000 people were infected with a mortality of approximately 10%. Although no new infections have been observed since the summer of 2003, a recurrence of the pathogen cannot be excluded. Up to now, no specific therapy against the virus have been available. Viruses contain a very compact genome, which does not encode all proteins necessary for independant replication. Thus, viruses necessarily depend on host proteins and have to interact directly with them. The analysis of protein-protein interactions between SARS-CoV and human host cells contributes to a better understanding of the viral replication and pathogenicity. Prior to this work, an automated, genome-wide yeast-two-hybrid (Y2H) screen between all 28 proteins of SARS-CoV and the gene products of three human cDNA libraries had been performed, and approximately 460, mostly new protein-protein interactions had been identified. The aim of this work was to confirm newly identified virus-host SARS-CoV protein interactions and to functionally analyse them to identify new targets for antiviral therapy. 89 newly identified protein-protein interactions were examined via a modified LUMIER binding-assay to confirm individual interactions. 37 out of 89 protein interactions were found to be positive, resulting in a confirmation rate of 42%. In subsequent functional analyses of protein-protein interactions between the SARS-CoV non-structural protein 1 (Nsp1) and proteins of the immunophilin family, two different functional consequences were observed. First, it could be shown that SARS-CoV Nsp1 boosts the expression of genes regulated via the calcineurin/NFAT-signalling cascade. The increased expression of NFAT-regulated genes in SARS-CoV infection may cause the cytokine dysregulation described in SARS patients which leads to severe lung tissue destructions and which correlates with high mortality. The considerably less harmful human coronavirus HCoV-NL63 and mouse coronavirus (MHV) did not boost the expression of NFAT-regulated genes. It was thus hypothesized that the therapy of the cytokine dysregulation with the immunosuppressive drug Cyclosporine A (CspA) might improve the course of the disease. In addition, it could be shown for the first time that the replication of the SARS-CoV can be inhibited by the immunosuppressive drug CspA. Subsequent experiments showed a similar inhibition of the viral replication of the less harmful human coronavirus HCoV-NL63 and HCoV-229E mediated by CspA. In cooperation with several groups of the ”SARS-Zoonose- Verbund”, further inhibition experiments were performed with animal coronaviruses like FCoV, IBV Bd and TGEV PUR46, which showed a similar antiviral effect of CspA. The two cellular proteins Cyclophilin A and FK506 binding-protein 1A were shown to be essential for viral replication of HCoV-NL63. The findings of this work may contribute to a better understanding of the interactions between SARS-CoV and infected host cells and their innate immune response. The application of the general coronaviral inhibitor CspA identified in this study and of non-immunosuppressive CspA analogues like DEBIO-025 procures promising options for anti-coronaviral therapy.

Dendritic cells (DCs) play a key role in the initiation of adaptive immune responses and the maintenance of self-tolerance. Due to their therapeutic potential, understanding the mechanisms that guide DC differentiation and effector functions is important. DC differentiation and activation depends on transcription factor control of stage-specific gene expression. The recent identification of posttranscriptional control of gene expression by microRNAs (miRNAs) has added another layer of gene regulation that might be important in DC biology. We analyzed the miRNA expression profiles of different DC subsets and identified several miRNAs differentially expressed between plasmacytoid DCs (pDCs) and conventional DCs (cDCs). In terms of miRNA expression, pDCs were more closely related to CD4+ T cells than to cDCs. We also observed that pDCs and cDCs preferentially expressed miRNAs associated with lymphoid or myeloid lineage differentiation, respectively. By knocking down miR-221 or miR-222 during in vitro DC differentiation, we obtained a higher pDC frequency. While p27kip1 and c-kit are confirmed miR-221/222 targets, we additionally identified the pDC cell fate regulator E2-2 as a potential miR-221/222 target. Thus, our analysis points to a role for miRNAs in directing and stabilizing pDC and cDC cell fate decisions. To assess the general influence of miRNAs on DCs, we generated mice with a DC-specific conditional knockout of the key miRNA-producing enzyme Dicer. Dicer-deficient mice dis- played no alterations in short-lived spleen and lymph node DCs. However, long-lived epidermal DCs, known as Langerhans cells (LCs), showed increased turnover and apoptosis rates, leading to their progressive loss. Upon stimulation, Dicer-deficient LCs were able to properly upregulate the surface molecules MHC class I and CCR7, but not MHC class II, CD40 and CD86. In consequence, they were incapable of stimulating CD4+ T cell proliferation. The work presented in this thesis indicates a role for miRNAs in DC regulation not covered by transcription factors. Having demonstrated a role for miRNAs in DC lineage fate decisions, as well as in LC homeostasis, maturation and function, we conclude that miRNAs regulate various aspects of DC biology and thereby contribute to the control of adaptive immune responses.

Mutations in the gene coding for the ATP binding cassette protein A3 (ABCA3) are known as the most frequent genetic cause of fatal neonatal respiratory distress syndrome and chronic interstitial lung disease (ILD) of children. ABCA3 transporter is localized to the limiting membrane of lamellar bodies, organelles for assembly and storage of pulmonary surfactant in alveolar epithelial type II cells. It transports surfactant phospholipids into lamellar bodies and is essential for their biogenesis. ABCA3 mutations can result in either functional defects of the correctly localized ABCA3 or trafficking/folding defects where mutated ABCA3 remains in the endoplasmic reticulum (ER). This study showed previously not examined cellular dysfunction in cultured lung epithelial A549 cells overexpressing the three ABCA3 mutations R43L, R280C and L101P. All three mutations were found in children with ABCA3-associated lung disease either with fatal neonatal respiratory distress syndrome (L101P and R43L) or chronic pediatric ILD (R280C). Cell biology of R43L and R280C mutations was studied here for the first time. L101P mutation was used as a known example of the trafficking/folding defect leading to the ER retention of ABCA3 protein. Human lung epithelial A549 cells were transfected with vectors containing wild type ABCA3 or one of the three ABCA3 mutant forms, R43L, R280C and L101P, C-terminally tagged with YFP or hemagglutinin-tag. Localization/trafficking properties were analyzed by immunofluorescence and ABCA3 deglycosylation. Uptake of fluorescent NBD-labeled lipids into lamellar bodies was used as a functional assay. ER stress and apoptotic signaling were examined through RT-PCR based analyses of XBP1 splicing, immunoblotting or FACS analyses of stress- and apoptosis-proteins, Annexin V surface staining and determination of the intracellular glutathion level. Induction of epithelial-mesenchymal transition (EMT) was assessed by immunoblotting. It was demonstrated that two ABCA3 mutations, which affect ABCA3 protein trafficking/folding and lead to partial (R280C) or complete (L101P) retention of ABCA3 in the ER compartment, can elevate ER stress and susceptibility to it and induce apoptosis in A549 cells. A549 cells expressing L101P additionally gain a mesenchymal phenotype. R43L mutation, resulting in a functional defect of the properly localized ABCA3, had no effect on intracellular stress and apoptotic signaling. These data suggest that expression of partially or completely ER localized ABCA3 mutant proteins induce raised intracellular stress and apoptotic cell death of the affected cells, which are factors that might contribute to the pathogenesis of genetic ILD via a fatal ER-stress/apoptosis/fibrogenesis-axis.

Ziel dieser Arbeit war es, die Sensitivität des Tumormarkers Chromogranin A (CgA) für neuroendokrine Tumoren (NETs) des gastroenteropankreatischen Systems (GEP) bei dem von uns verwendeten Assay zur Bestimmung von CgA zu berechnen und mit Daten anderer Zentren zu vergleichen. Hierfür analysierten wir die CgA-Serumwerte von 110 Patienten mit neuroendokrinen Tumoren (Midgut-NET n=62, Pankreas-NET n=48) in einer retrospektiven Studie mit den Daten unserer Klinik. Die CgA-Werte wurden durch einen kommerziell verfügbaren immunoradiometrischen Assay (IRMA, CIS-bio) bei Patienten der Medizinischen Klinik II, Campus Großhadern der Ludwig-Maximilian- Universität München, in den Jahren von 2000 – 2009 (Cutoff-Level: CgA < 98 ng/ml) bestimmt. In der gesamten Studienpopulation lag die CgA-Sensitivität für Patienten mit einem Midgut-NET höher als bei Patienten mit einem Pankreas-NET (68 % bzw. 54 %). Für beide Gruppen (Midgut- und Pankreas-NETs) konnte bei Patienten mit Lebermetastasen eine höhere CgA-Sensitivität als bei Patienten ohne Lebermetastasen nachgewiesen werden (Midgut: 77 % versus 40 %; Pankreas 63 % versus 31 %). Es zeigten sich außerdem signifikant höhere mediane CgA-Werte bei Patienten mit Lebermetastasen (n = 82; Median ± Standardabweichung: 389 ± 38103 ng/ml) als bei den Patienten ohne hepatische Metastasierung (n = 28; Median ± Standardabweichung: 65 ± 181 ng/ml) (p < 0,0001). Bei Patienten, die neben den Lebermetastasen noch weitere Metastasenherde (Knochen, Peritoneum oder Lunge) aufwiesen, zeigten sich sogar noch deutlich höhere CgA-Werte (n = 29; Median ± Standardabweichung: 1011 ± 63224 ng/ml) als bei Patienten die neben den Leberherden nur noch Lymphknotenbefall aufwiesen (n = 53; Median ± Standardabweichung: 196 ± 4427 ng/ml) (p = 0,005). Wir evaluierten außerdem die Sensitivität für 5-Hydroxy-Indolessigsäure, gemessen im 24-Stundensammelurin bei 51 Midgut-NET-Patienten und konnten hier eine Gesamtsensitivität von 69 % nachweisen. In der Untergruppe der Patienten mit hepatisch metastasiertem Midgut-NETs zeigte sich eine deutlich höhere Sensitivität 48 von 87,5 %. Außerdem konnten wir eine signifikante Korrelation zwischen den medianen CgA- und 5-HIES-Werten nachweisen (r = 0,752; p < 0,0001). Die alkalische Phosphatase (AP) zeigte nur eine niedrige Sensitivität für Pankreas- und Midgut-NETs von 42 % bzw. 26 %. Eine etwas höhere Sensitivität von 49 % bzw. 32 % konnte für die Untergruppe der hepatisch metastasierten Pankreas- und Midgut-NETs nachgewiesen werden. Zwischen den CgA- und AP-Werten konnte weder für die Pankreas-NET-Gruppe (r = 0,362) noch für die Midgut-NET-Gruppe (r = 0,208) eine signifikante Korrelation gefunden werden. Nach unseren Ergebnissen sowie den Ergebnissen bestehender Literatur hängt die CgA-Sensitivität von dem zur Messung verwendeten Assay, dem verwendeten Cutoff-Level, der Lokalisation des Tumorprimarius sowie von der Tumorlast ab. Chromogranin A scheint aufgrund der geringen Sensitivität im nicht metastasierten Stadium nicht zur primären Tumorsuche bzw. zum Screening geeignet, sondern sollte primär bei Patienten mit bereits bekanntem neuroendokrinen Tumor zur Tumornachsorge bzw. Verlaufskontrolle eingesetzt werden.