Arabidopsis thaliana unter Wasserstress: Transkriptionsprofile der MIP-Familie und von Genen aus dem Stress- und Sekundärstoffwechsel

MIPs (major intrinsic proteins) sind eine Gruppe von
Transport-Proteinen, die ubiquitär in Archaea, Pro- und Eukaryoten
zu finden sind. Neben spezifischen Wasserkanalproteinen
(Aquaporine) sind einige Mitglieder dieser Familie permeabel für
andere kleine und ungeladene Moleküle, wie z.B. Glycerin. Als
Grundlage zur Funktionsaufklärung der 38 MIP-Mitglieder in A.
thaliana wurden ihre transkriptionellen Reaktionen untersucht. Dazu
wurde ein DNA-Array mit Sonden aus dem 3´-untranslatierten Bereich
dieser Gene entwickelt, der die Unterscheidung der oft hoch
homologen Mitglieder auf Transkript-Ebene zuließ, wozu längere
cDNA-Sonden nicht geeignet sind. Eine TIP1;2 cDNA-Sonde, die Teile
der kodierenden Sequenzen enthielt, zeigte in einem
Hybridisierungsexperiment eine 40 %-ige Kreuzhybridisierung mit dem
homologen TIP1;1. Die Spezifität der Sonden wurde in Zusammenarbeit
mit dem Munich Information Center for Protein Sequences
bioinformatisch überprüft. Das stringente Auswahlkriterium dieser
Analysen, woraufhin eine Sonde bis zu einer 70 %-igen Homologie
über 70 bp nicht kreuzhybridisiert, konnte auch experimentell
gestützt werden. Der Vergleich der Signalintensitäten einer 172 bp
langen, spezifischen Sonde mit einer 774 bp langen cDNA-Sonde ließ
zudem darauf schließen, dass die Spezifität der verwendeten
3´-UTR-Sonden die Sensitivität nicht beeinträchtigte. Eine
Organ-spezifische Expressions-Analyse zeigte, dass MIPs in allen
untersuchten Organen (Wurzeln, Blätter, Stängeln, Blüten und
Schoten) exprimiert werden. Die meisten MIPs (24 von 38) und die
höchsten Expressionsniveaus wurden in der Wurzel detektiert. In
Blättern konnten hingegen nur 11 von 38 MIP-Mitgliedern
nachgewiesen werden. Die geringsten Expressionen zeigten die
Mitglieder aus der NIP- und SIP-Subfamilie. Zu den am höchsten und
in der Pflanze ubiquitär exprimierten MIPs zählten die
PIP-Mitglieder PIP1;1, PIP1;2 und PIP2;1 sowie die TIP-Mitglieder
TIP1;1 und TIP2;1, von denen bekannt ist, dass sie als
Wasserkanal-Proteine fungieren. Die Möglichkeit, die
Wasserpermeabilität von Membranen regulieren zu können, dürfte
somit von zentraler Bedeutung in der ganzen Pflanze sein. Neben
ubiquitär exprimierten MIPs sind einige nur ausschließlich oder
bevorzugt in bestimmten Organen zu finden, z.B. PIP1;4, PIP2;6 und
PIP2;7 in der Blüte und NIPs hauptsächlich in der Wurzel. Deren
Funktion könnte neben einem Organ- oder Zell-spezifischen
Wassertransport auch die Permeation anderer ungeladener Moleküle
beinhalten, da die Transporteigenschaften dieser Mitglieder nicht
geklärt sind. Das Expressionsprofil der MIP-Genfamilie in
verschiedenen Organen sowie die unterschiedliche Reaktion auf
Wasserstress (s.u.) lassen auf differenzielle Funktionen der
einzelnen MIP-Mitglieder schließen. Lediglich TIP1;1 und TIP1;2
konnten nach diesen Kriterien nicht eindeutig unterschieden werden.
Durch Zugabe von 100 mM NaCl und 200 mM Sorbiotol zu hydroponisch
angezogenen A. thaliana-Pflanzen wurde über einen Zeitraum von 48
Stunden die transkriptionelle Reaktion der MIP-Familie auf diese
Wasserstressbedingungen verfolgt. In Wurzeln wurde festgestellt,
dass innerhalb der ersten 24 Stunden bei beiden Stressoren die hoch
exprimierten PIP-Aquaporine PIP1;1 und PIP2;2 sowie PIP1;3
reprimiert, TIPAquaporine wie TIP1;1 und TIP2;1 zu diesem Zeitpunkt
jedoch unbeeinflusst sind. Die Pflanze verringert demnach bei
Wasserstress zuerst die Wasserpermeabilität der Plasmamembran,
sofern sich die transkriptionelle Suppression auf Proteinebene
widerspiegelt. Interessanterweise zeigte sich im Blatt eine frühe
Repression der hoch exprimierten TIPAquaporine TIP1;1 und TIP2;1.
Die in der Wurzel reagierenden Aquaporine aus der PIPSubfamilie
zeigen im Blatt jedoch keine transkriptionellen Änderungen.
Zusammenfassung 95 Diese frühen Repressionen von TIP1;1 und TIP2;1
lassen vermuten, dass es in Blättern wichtig ist, möglichst rasch
unter Wasserstress die Wasserpermeabilität des Tonoplasten zu
senken. Dies könnte der Stabilisierung des Zell-Turgors dienen
und/oder mit einem verringerten Blattwachstum einhergehen. Die
ähnlichen Transkriptionsantworten und Kinetiken der MIPs bei NaCl-
und Sorbitolstress lassen zudem vermuten, dass MIPs auch unter
NaCl-Stress primär auf die osmotische Veränderung in der Nährlösung
reagieren bzw. über ähnliche Signalwege reguliert werden. Die
parallele Untersuchung transkriptioneller Änderungen von bekannten
Stress-Markergenen und Genen des Sekundärmetabolismus unter NaCl-
und Sorbitolstress ergab zusätzliche Hinweise auf überlappende und
Stressor-spezifische Reaktionen in Wurzeln und Blättern. Eine
bekannte Reaktion auf Salz- und osmotischen Stress ist die Bildung
von reaktiven Sauerstoff-Spezies, die sowohl als Signalmoleküle
fungieren als auch Schädigungen verursachen können. Die Induktionen
der beiden Peroxidasen GPX1 und PRXCB in Blättern und Wurzeln
deuten auf eine Beteiligung bei Entgiftungsreaktionen von H2O2
unter Wasserstress hin. Einzelne Mitglieder aus der Familie der
UDP-Glycosyltransferasen und Cytochrom P450-Monooxygenasen, wie
UGT74F2 und CYP81D1, zeigten bei Salz- und Sorbitolstress
überlappende Reaktionen, was darauf hindeutet, dass spezifische
Teile des Sekundärstoffmetabolismus ähnlich beeinflusst werden.
Daneben zeigten andere Mitglieder aus diesen Gen-Familien
spezifische Reaktionen auf die beiden Stressoren. So waren in der
Wurzel nach 48 Stunden Sorbitolstress viele CYPs und UGTs
reprimiert. Die Pflanze scheint also exklusiv bei Sorbitolstress
spezifische, in ihrer genauen Funktion noch unbekannte Teile des
Sekundärmetabolismus zu supprimieren. Die unterschiedlichen
Reaktionen einer Reihe weiterer Gene auf Salz oder Sorbitol in
Blättern und Wurzeln identifizierten zudem differenzielle
Stress-Antworten innerhalb der Pflanze. Es wurden zwei
Insertionsmutanten in den MIP-Genen PIP2;1 und PIP1;4 isoliert.
Transkript-Untersuchungen dieser Mutanten zeigten, dass durch das
Ausschalten dieser PIPs alle anderen MIP-Mitglieder, sowohl bei
ungestressten als auch unter NaCl-Stress- Bedingungen, keine
Änderungen in ihrer Transkriptionsantwort im Vergleich zum Wildtyp
zeigen. Möglicherweise besitzen die untersuchten PIP-Mitglieder
eine spezifische Funktion, die andere MIPs nicht kompensieren
können, oder möglicherweise kommt es in der Pflanze zu veränderten
Reaktionen, die anhand der vorliegenden Untersuchungen nicht
erkennbar waren.