Massenspektrometrische Untersuchung posttranslationaler Modifikationen

Nach der kompletten Sequenzierung des menschlichen Genoms im Rahmen
des „Human Genome Project“ sind sich die Experten einig, dass die
Forschung sich nun den Vorgängen der komplexen
Regulationsnetzwerken auf der Proteinebene widmen muß. Die
Proteomforschung bedient sich dabei der möglichst optimalen und
quantitativen Auflösung von komplexen Proteingemischen. Um dies zu
ereichen werden die Proteine mittels zweidimensionaler
Gelelektrophorese (2D-SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese)
aufgetrennt. Im Rahmen der vorliegenden Promotion sollten am
Beispiel ausgewählter relevanter Blutplasmaproteine das Phänomen
der „ladder of spots“ untersucht werden. Dies sind Leitern von
Proteinspots, die einem einzigen Protein zugeordnet werden können,
sich jedoch in der ersten Dimension, der isoelektrischen
Fokussierung (IEF) aufgrund ihrer Nettoladung unterscheiden und
aufgetrennt werden. Vor allem in 2D-Gelen von Blutplasma sind eine
ganze Reihe solcher Leitern zu beobachten, und in der Regel werden
sie durch posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierungen
oder Phosphorylierungen verursacht. In der vorliegenden Arbeit
konnte jedoch der Einfluss von Alterungsprozessen auf der
Proteinebene nachgewiesen werden, der zu der Veränderung dieser
Proteine in Form von Deamidierungen der Asparagin- und
Glutaminaminosäuren beiträgt. Der Mechanismus der Alterung wurde
ebenfalls genauer untersucht, da diese Art von
Modifikationsreaktion in der Natur sowohl chemisch als auch
enzymatisch ablaufen kann. Hier spielt natürlich auch die Art und
Weise der Probenvorbereitung eine große Rolle bei möglichen
posttranslationalen Modifikationen. Einen weiteren Schwerpunkt
dieser Arbeit bildete die Klonierung eines der ausgewählten
Proteine (ß2-Microglobulin) in E.coli mittels molekularbiologischer
Techniken. Ziel der Klonierung war es festzustellen, zu welchem
Zeitpunkt die zuvor entdeckten posttranslationale Modifikation im
Rahmen der natürlichen Alterung von Proteinen auftritt.