Charakterisierung der Rolle und Funktion der Protein-Tyrosin-Phosphatase Meg2

In dieser Arbeit wurde die biologische Funktion der PTP-Meg2 in der
zellulären Signaltransduktion untersucht. Analysen mittels
c-DNA-Filter, „Real Time PCR” und Immunblot zeigen eine ubiquitäre
Expression der PTP-Meg2 auf ähnlichem, jedoch geringem Niveau in
fast allen untersuchten Krebszelllinien unterschiedlicher
Gewebeherkunft, wobei die Expressions-stärke nicht in direktem
Zusammenhang mit krebsrelevanten Eigenschaften wie Invasivität und
Metastasierung steht. Die induzierte Differenzierung von MCF
7-Zellen durch Natriumbutyrat steigert die Meg2-Expression um das
5-fache, wogegen die Differenzierung von SW948- und SK-N- SH-Zellen
mit TPA bzw. Retinolsäure die Meg2-Expression reprimiert.
Zellfraktionierung und Immunfluoreszenz zeigen eine primär
zytosolische, aber partiell auch vesikuläre bzw. strukturierte
Lokalisation der PTP-Meg2, für welche die CRALBP-Domäne der
PTP-Meg2 mitverantwortlich ist. Untersuchungen der endogenen
Meg2-Aktivität nach Immunpräzipitation und in vitro
Phosphatasetests zeigen eine erhöhte Phosphataseaktivität nach
Stimulation von Zellen mit FCS, EGF und LPA, wogegen TPA stark
inhibierenden wirkt. Aktivitätsstudien mit
GST-Meg2-Fusionsproteinen zeigen, dass die CRALBP-Domäne die
Meg2-Phosphataseaktivität negativ reguliert. Im
Protein-Lipid-Overlay interagiert PTP-Meg2 mit PI(3)P, PI(4)P,
PI(5)P und Phosphatidylserin. Eine Interaktion mit PI(4)P führt zu
einer erhöhten Meg2 Aktivität. Pervanadat-Stimulation von Zellen
führt zu einer Tyrosinphosphorylierung sowie einer
Mobilitätsänderung der PTP-Meg2, was auch mit einer katalytisch
inaktiven Meg2-Mutante beobachtet wurde. PTP-Meg2 interagiert in
vitro und in Koexpressionsstudien mit dem EGF-Rezeptor in
Abhängigkeit von dessen Aktivierung. Eine physiologische Relevanz
konnte nicht gezeigt werden. Die Depletion der PTP-Meg2 durch
spezifische siRNA führt zu einer erhöhten Tyrosinphosphorylierung
einiger, noch zu identifizierender Proteine. PTP-Meg2 vermindert,
die inaktive PTP-Meg2CS-Mutante erhöht die durch v-ErbB und
EGF-Rezeptor, nicht aber die durch HER2 und v-Ki-Ras induzierte
Transformation von NIH3T3-Zellen im Focusbildungstest. Zudem
bewirkt PTP-Meg2CS, mit Ausnahme der v-Ki-Ras infizierten Zellen,
eine leicht erhöhte ERK1/2-Aktivität. Ferner stimuliert PTP-Meg2
die Migration von NIH3T3-Zellen im Wundheilungsexperiment. Ein
Einfluss auf die basale und durch Stimuli induzierte Proliferation
von Zellen in Wachstumstests wurde nicht beobachtet. Ein durch
siRNA-vermittelter Meg2- „knockdown“ führte zur Induktion bzw.
Repression der Expression von Genen, wie z.B. einiger Liganden,
Caveolin-2, Nck und Rock, was auf eine Beteiligung der PTP-Meg2 an
der Regulation von Signalwegen kleiner GTPasen bzw. von endo- sowie
exocytotischen Prozessen schließen lässt.