Untersuchungen zur Heteromerisierung, Funktion und genetischen Struktur von HCN Schrittmacherkanälen

Die HCN Kanäle spielen als molekulare Basis des Ih Stroms eine
bedeutende Rolle bei der Entstehung rhythmischer Erregungen. Die
HCN Familie der Säugetiere besteht aus vier Mitgliedern
(HCN1-HCN4), die in unterschiedlichem Ausmass in verschiedenen
Regionen von Herz und Gehirn exprimiert werden. Im Rahmen der
vorliegenden Arbeit wurden die Bildung von Heteromeren zwischen den
einzelnen Isoformen, die Glycosylierung der Kanäle und deren
Funktion, die Modulation durch cAMP, die Aktivierung in Bezug auf
Kinetik und Spannungsabhängigkeit, sowie die Rolle von HCN
Kanal-Genen im Rahmen von genetischen Erkrankungen untersucht.
Sowohl im Mausgehirn wie auch in HEK Zellen können die HCN
Kanal-Untereinheiten miteinander interagieren. Im Mausgehirn wurde
die Heteromerisierung von HCN1 und HCN2 durch Ko-Immunpräzipitation
nachgewiesen. Durch konfokalmikroskopische Studien an EGFP- bzw.
RFP-markierten HCN Isoformen in HEK Zellen konnte für alle
HCN-Zweierkombinationen ausser mHCN2 mit mHCN3 eine Kolokalisation
im Bereich der Plasmamembran beobachtet werden. Bestätigt wurden
diese Ergebnisse durch Ko-Immunpräzipitation. Mit Hilfe von
elektrophysiologischen Untersuchungen konnte verifiziert werden,
dass mHCN2 und mHCN3 nicht interagieren. Die HCN Kanäle werden in
vivo (Mausgehirn) und in vitro (HEK Zellen) N-glycosyliert. Am
Beispiel des mHCN2 wurde die physiologische Relevanz dieser
posttranslationalen Modifikation untersucht. Ein mutanter,
unglycosylierter mHCN2 Kanal wird nicht mehr zur Plasmamembran
transportiert und generiert keinen charakteristischen Einwärtsstrom
mehr. Nach Koexpression mit hHCN4 ist die Membranständigkeit dieser
Mutante wieder gegeben, sowie auch die Kolokalisation der beiden
Kanäle. Im Gegensatz hierzu konnte mHCN3 den unglycosylierten mHCN2
nicht zur Zellmembran transportieren, da zwischen den beiden
Kanälen ganz offensichtlich keine Bindung bestehen kann. Die für
die Bindung von cAMP an den mHCN2 Kanal essentielle Aminosäure
Arginin 591 wurde durch gerichtete Mutagenese und
Patch-Clamp-Untersuchungen identifiziert. Der Ersatz des Arginin
591 führt zu mHCN2 Kanälen, die bei Anwesenheit von cAMP nicht mehr
wie der Wildtyp Kanal eine Verschiebung der halbmaximalen
Aktivierung zu positiveren Potentialen zeigen. Durch
elektrophysiologische Charakterisierung von verkürzten mHCN2
Kanälen und Chimären aus mHCN1 und mHCN2 konnten den Unterschieden
in Aktivierungskinetik und Spannungsabhängigkeit der HCN Isoformen
konkrete Kanalteile zugeordnet werden. Für die Geschwindigkeit der
Aktivierung sind die Kernregion und ein Stück des C-Terminus
verantwortlich, während der C-Terminus die Spannungsabhängigkeit
bestimmt. Die genomische Analyse des HCN2 von Cayman
Ataxie-Patienten, die zerebrale Dysfunktionen ähnlich denen von
HCN2-knockout Mäusen zeigen, ergab keine Unterschiede im Vergleich
zu einem gesunden Probanden. Eine Mutation im HCN2 Gen als Ursache
der Cayman Ataxie kann somit ausgeschlossen werden, es besteht
jedoch die Möglichkeit einer Störung der Proteinsynthese oder
posttranslationaler Modifikationen. Auch bei zwei Patienten, die an
familiär bedingtem Sick Sinus Syndrom leiden, konnte die Ursache
der Erkrankung nach genomischer Sequenzanalyse nicht durch einen
Defekt des HCN2 Gens oder des HCN4 Gens erklärt werden.