Peptid-induzierte Antikörper als hochspezifische Werkzeuge der modernen Proteom-Analyse

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, das es
erlaubt, von in silico Sequenzdaten ausgehend einzelne Proteine in
Proteomen direkt zu adressieren. Diese gezielte, quantitative
Detektion einzelner Proteine im Proteom ist mit den klassischen
Methoden der Proteomanalyse (2D Gelelektrophorese mit
anschließender proteinchemischer Identifizierung einzelner Spots)
nicht möglich, da das Laufverhalten des „gesuchten“ Proteins,
aufgrund potentieller posttranslationaler prinzipiell nicht
hinreichend genau vorhergesagt werden kann. Das im Rahmen dieser
Arbeit entwickelte Verfahren beruht auf der Generierung von
Peptid-Antikörpern, die sensitiv und spezifisch einzelne Proteine
in Proteomen detektieren können. Die benötigten Peptid-Antigene
werden hierfür ausschließlich von in silico Sequenzinformationen
des Zielproteins abgeleitet und vollsynthetisch hergestellt.
Zunächst wurde Entwicklungsarbeit bezüglich der effizienten
Titration Peptid-induzierter Antiseren geleistet. Die ELISA-Analyse
Peptid-induzierter Antikörper ist nicht trivial, weil
Standard-Mikrotiterplatten mit kurzen synthetischen Peptiden nur
mangelhaft beschichtet werden können, was geringe Sensitivität der
Analyse zur Folge hat. Es konnte gezeigt werden, dass durch die
Kopplung von biotinylierten Peptiden an Streptavidin-beschichtete
Mikrotiterplatten die Sensitivität der ELISA-Analyse deutlich
gesteigert werden konnte und das System hervorragend für die
Titration Peptid-induzierter Seren geeignet ist. Wesentliche
Entwicklungsarbeit wurde hinsichtlich geeigneter Carrier-Systeme
zur Steigerung der Immunantwort gegen das Peptid-Antigen geleistet.
Hierfür wurden verschiedene Carrier auf Kunststoffbasis,
verschiedene klassische Protein-Carrier und kurze peptidische
T-Zell-Epitope getestet. Mit einem vollsynthetischen, 15 AS langen
Masernvirus-Fusions-Protein-T-Zell-Epitop konnte die Immunantwort
am effektivsten gesteigert werden. Mit diesem Peptid-Carrier
gelangen höhere Raten erfolgreicher Immunisierungen als mit den
klassischen Carrier-Proteinen. Der wesentliche Vorteil dieses
vollsynthetischen Carrier-Systems ist, dass die Induktion
unerwünschter Kreuzreaktivität durch das Carrier-Protein und der
daraus folgende Verlust an Spezifität der Seren a priori vermieden
wird. Außerdem können diese Konstrukte, ohne chemische
„Crosslinker“, vollsynthetisch und in hoher Reinheit hergestellt
und deren Identität, im Gegensatz zu Protein-gekoppelten Peptiden,
mittels MS verifiziert werden. Als anspruchsvoller Sensitivitäts-
bzw. Spezifitätstest, wurden mit Peptid-induzierten Antikörpern im
2D-Western-Blot, Proteine diverser Funktionsklassen nachgewiesen.
Alle Zusammenfassung 165 nachzuweisenden Proteine wurden im
2D-Western-Blot gezielt und hintergrundfrei detektiert. Die
Detektionsgrenze der Peptid-induzierten Seren lag zwischen 313 fmol
und 4 fmol Einzelprotein, was sensitiver ist als die routinemäßig
verwendeten MS-basierten Proteinidentifizierungs-Verfahren. Mit
Peptid-Arrays, die mit der Technik der Spot-Synthese hergestellt
wurden, ist das Bindungsverhalten der Peptid-induzierten Antikörper
weiter untersucht worden. Dabei konnte festgestellt werden, dass
überraschenderweise die überwiegende Zahl der generierten
Peptid-induzierten Antikörper an definierte ca. 5-9 AS lange
Teilsequenzen der bis zu 20 AS langen Peptid-Antigene binden. Diese
besonders bemerkenswerte Eigenschaft, die bislang nur in
Zusammenhang mit monoklonalen Antikörpern bekannt ist, gab den
Anlass, das Verfahren zum Patent anzumelden. Ferner wurde ein
Verfahren entwickelt, das unter Verwendung von Peptid-induzierten
Antiseren die Produktion von Antikörper-basierten Chips ermöglicht.
Mit Protein A Partikeln als feste Phase ist es im Unterschied zu
anderen häufig verwendeten Trägermaterialien gelungen, eine
ausreichende Menge an Antikörpern direkt aus dem Rohserum zu
binden, um einzelne Proteine in komplexen Proteingemischen (z.B.
eukaryontischen Zell-Lysate) zu detektieren. Das Verfahren hat den
Vorteil, dass einfach und schnell größere Mengen von Partikeln
beschichtet und asserviert werden können. Mit den Partikeln können
z.B. Antikörperchips individuell, für spezifische Fragestellungen
angefertigt werden (sog. „custom designed“ Antikörperchips).
Dadurch wird es möglich, ein Set von Proteinen in einer Vielzahl
von Proben schnell, parallel und quantitativ zu detektieren.