Das Dhh1 Protein aus Saccharomyces cerevisiae

Das Dhh1 Protein aus Saccharomyces cerevisiae ist aufgrund von acht
hoch konservierten Aminosäure-Motiven als putative RNA Helikase
klassifiziert. In S. pombe (Ste13p), Drosophi-la melanogaster
(ME31B), Xenopus laevis (Xp54), Mus musculus (mmRCK) und Homo
sa-piens (hRCK/p54) findet man Proteine, die zu Dhh1p eine sehr
hohe Konservierung von bis zu 83 % aufweisen. Lediglich der N- und
C-Terminus dieser Proteingruppe ist nicht konserviert. In der
vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung der Deletion von DHH1 in
Saccharomyces cerevisiae auf verschiedene Aspekte der DNA
Schädigung und Reparatur, sowie die Funktio-nalität verschiedener
Domänen von Dhh1p durch Mutationsanalysen untersucht. Im ersten
Teil der Arbeit wurde das DHH1 Gen in verschiedenen Hefestämmen
deletiert und die Auswirkungen von DNA schädigenden Substanzen auf
diese Mutanten untersucht. Die De-letion von DHH1 führte zu einer
starken Erhöhung der Sensitivität von Hefezellen sowohl ge-genüber
Bleomycin als auch gegenüber MMS. Allerdings zeigten dhh1D-Zellen
nur eine schwache Sensitivität gegenüber UV-Strahlung und keine
Sensitivität gegenüber g-Strahlung. Dies weist sehr stark darauf
hin, dass die beobachteten Sensitivitäten auf einem eventuell durch
Membrandefekte verursachten, sogenannten „uptake“-Phänotyp beruhen.
In „uptake“ unabhängigen Experimenten wurde die Funktionalität des
Non-homologous End-joining Repa-raturweges der Hefe untersucht.
Dabei konnte gezeigt werden, dass dhh1D-Stämme eine um den Faktor
fünf reduzierte Effizienz in der Rezirkularisierung linearisierter
Plasmide zeigen. Allerdings ist nur die Effizienz, nicht die
Genauigkeit des End-joining in dhh1D-Stämmen be-troffen – die
rezirkularisierten Plasmide wurden zu 100 % genau repariert. Dies
weist darauf hin, dass die Deletion sich auf mehr als nur einen
einzelnen Aspekt zellulä-rer Vorgänge auswirkt. Im zweiten Teil der
Arbeit wurde die extreme Sensitivität der dhh1D-Stämme gegenüber
Ble-omycin und MMS als Testsystem für die funktionelle
Charakterisierung verschiedener Dhh1p Domänen verwendet. Dabei
zeigte sich, dass eine Deletion des N-Terminus von Dhh1p kaum
Einfluss auf die Funktionalität des Proteins hat. Die Deletion des
C-Terminus führt zu einer deutlichen Sensitivität der Zellen
gegenüber Bleomycin. Bei Deletion beider Termini wachsen die Zellen
auf Bleomycin nur noch geringfügig besser als der dhh1D-Stamm.
Diese Effekte werden durch Überexpression der verkürzten Proteine
aufgehoben. Keine der drei Verkürzun-gen hat Einfluss auf das
Wachstum auf MMS-haltigen Platten. Die Mutation der ATPase Domäne
(Walker A Motiv) hebt die Funktion des Proteins fast voll-ständig
auf. Diese Mutanten sind nahezu so sensitiv gegenüber Bleomycin,
wie dhh1D Zellen. Die Überexpression der ATPase Mutante führt im
Gegensatz zu den Verkürzungen zu keiner Verringerung der
Sensitivität gegenüber Bleomycin. Die zusätzliche Entfernung der
Termini in der ATPase Mutante führt nicht zu einer Erhöhung der
Bleomycin-Sensitivität. Allerdings zeigt die Dreifachmutante
deutlich schlechteres Wachstum auf MMS-haltigen Platten. Die
Mutation des SAT-Motives in AAA führt ebenfalls zu einer deutlichen
Bleomycin-Sensitivität. Der Phänotyp ist vergleichbar mit den
Auswirkungen der Deletion des C-Terminus. Das ur-sprünglich als RNA
Entwindemotiv charakterisierte SAT-Motiv wind mittlerweile eher als
eine Art „Scharnier“ angesehen, das eine Bewegung der Domänen 1 und
2 im Dhh1 Protein relativ zueinander ermöglicht. Die Auswirkung der
Mutation des SAT-Motivs in AAA im Vergleich zu den Verkürzungen und
den ATPase Mutanten weist auf eine eher strukturelle Rolle des
SAT-Motives in Dhh1p hin. Aus diesen Daten ließ sich ein
vorläufiges Modell über die Funktionsweise des Dhh1 Proteins
ableiten. In in vitro Experimenten wurde mit dem IMPACT-System
aufgereinigtes Dhh1 Protein auf seine Fähigkeit hin untersucht, DNA
und RNA zu entwinden. Für die verwendeten Substrate konnte keine in
vitro Helikase Aktivität festgestellt werden. Zur Analyse der
ATPase Aktivität wurde IMPACT-gereinigtes Dhh1p und durch
Immunopräzipitation aus Heferohextrakten ge-wonnenes Protein
eingesetzt. In beiden Fällen konnte keine ATP Hydrolyse beobachtet
wer-den, obwohl die Mutationsanalyse eindeutig darauf hinweist,
dass die ATPase Aktivität essen-tiell für die Funktion des Dhh1
Proteins ist.