Einzelmolekülspektroskopie von organischen Farbstoffmolekülen in porösen Festkörpern und Tieftemperaturspektroskopie an dem grün fluoreszierenden Protein

Die Anwendung der Einzelmolekülspektroskopie auf poröse Festkörper
wird erstmals in dieser Arbeit beschrieben. Um diese relativ neue
Methode auf die Untersuchung von Farbstoffen in porösen Festkörpern
anzuwenden, wurde ein konfokales Mikroskop so umgebaut, daß es zur
Detektion und Spektroskopie einzelner Moleküle einsatzfähig ist.
Dafür wurden verschiedene optische Detektionssysteme aufgebaut, um
alle im Fluoreszenzlicht enthaltenen Informationen zu erhalten. Mit
einer Avalanche Photodiode wurde die Empfindlichkeit des Mikroskops
auf die Detektion einzelner Lichtquanten gesteigert. Mit einem
gepulsten Laser wurde der ZeitbereichObwohl die
Einzelmolekülspektroskopie im Vordergrund der Arbeit steht, sind
auch einige interessante Beobachtungen an porösen Materialien mit
vielen Farbstoffmolekülen (Ensemblemessungen) durchgeführt worden.
Aufgrund des hohen dreidimensionalen Auflösungsvermögen des
konfokalen Mikroskopes war es möglich, auch an nur wenige
Mikrometer großen Kristallen ortsaufgelöste Untersuchungen
durchzuführen. Bisher war es oft nicht möglich, zwischen
Oberflächeneffekten und Eigenschaften, die in der Porenstruktur
hervorgerufen werden, zu unterscheiden. Untersuchungen mit vielen
Farbstoffmolekülen (Ensemblemessungen) zeigten, daß auch scheinbar
perfekte Kristalle im Inneren oft unregelmäßig aufgebaut sind. So
wurde eine Methode entwickelt, um Defektstrukturen in Kristallen
mit Fluoreszenzfarbstoff anzufärben und dreidimensional mit dem
konfokalen Mikroskop darzustellen. Große kalzinierte MFI Kristalle
besitzen Defektstrukturen, die sich im Inneren entlang der langen
Kristallachse ausbreiten. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß
scheinbar homogen mit Farbstoff beladene Kristalle oft eine sehr
ungleichmäßige Farbstoffverteilung besitzen. Auch Kristalle, die
schon während der Synthese mit Farbstoff beladen werden, sind oft
nicht gleichmäßig beladen. Dreidimensionale Fluoreszenzbilder von
großen und regelmäßig aufgebauten AlPO4-5 Kristallen, die mit dem
Farbstoff DCM beladen wurden, zeigten verschiedene geordnete und
ungeordnete Strukturen. Durch die Analyse der Polarisation kann die
Orientierung der Farbstoffmoleküle untersucht werden.
Untersuchungen an verschieden großen Oxazin Farbstoffen, die
während der Synthese in AlPO4-5 eingebaut wurden, zeigten, daß die
Ausrichtung entlang der Porenrichtung mit steigender Molekülgröße
abnimmt. Das kleine Oxazin 1 ist noch relativ gut orientiert,
während das große Oxazin 750 ohne Vorzugsrichtung eingebaut wird.
In verschiedenen M41S Materialien wurde die Diffusion von Farbstoff
untersucht. Fluoreszenzbilder von M41S Monolithen zeigten das
Eindiffundieren verschiedener Farbstoffe in den Festkörper. Über
die zeitabhängige Analyse der Eindringtiefe konnten dadurch die
Diffusionskonstanten ermittelt werden. Es zeigte sich, daß die
Diffusion jeweils bei geladenen Molekülen, größeren Molekülen und
bei kalziniertem Monolithen verlangsamt wird. Die Untersuchung des
Diffusionsverhaltens in einer M41S Nadel zeigte eine etwa doppelt
so schnelle Diffusion quer zur Nadel. Dies steht in Übereinstimmung
zu elektronenmikroskopischen Bildern, die zeigen, daß die Nadeln
aus zirkularen Poren besteht, die quer zur Nadelrichtung orientiert
sind. Im Verlauf dieser Arbeit wurden erstmals einzelne
Farbstoffmoleküle innerhalb von porösen Festkörpern detektiert. Im
Vergleich zu Referenzproben, bei denen der Farbstoff in einer
dünnen Polymerschicht eingebettet wird, ist das Signal zu
Untergrund Verhältnis der Einzelmoleküluntersuchungen in den
porösen Festkörpern etwas geringer. Auch an der Photostabilität der
Fluoreszenzfarbstoffe konnte durch die Einlagerung in die
Porenstrukturen keine Verbesserung beobachtet werden. Die Moleküle
können nicht nur detektiert, sondern auch spektroskopiert werden.
Dabei konnten durch die Analyse der Fluoreszenz verschiedene
Parameter bestimmt werden, wie folgende Tabelle zeigt: der
Detektion bis hinab in den Nanosekundenbereich erweitert. Durch den
Einbau einer Lambda-Halbe Platte wurde die Polarisation des
Laserlichtes beeinflußt, um die Orientierung eines einzelnen
Moleküls zu bestimmen. Schließlich wurde durch den Einsatz eines
Prismas und einer empfindlichen CCD-Kamera die spektrale
Aufspaltung ermöglicht, um damit die Fluoreszenzspektren zu
bestimmen. Mit allen Experimenten war es nicht nur möglich
statische Eigenschaften der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe zu
bestimmen, sondern auch deren dynamische Veränderungen. Eine der
wichtigsten Anforderungen an organische Farbstoffmoleküle für
Einzelmolekülspektroskopie ist die Photostabilität. Um geeignete
Farbstoff für den Einbau in die Porenstrukturen zu erhalten, wurden
die Photostabilitäten verschiedener Farbstoffe untersucht. Dazu
wurden von einigen ausgewählten Farbstoffen die detektierbaren
Fluoreszenzphotonen gezählt. Es stellte sich heraus, daß das
Farbstoffmolekül TDI in einer dünnern PMMA Schicht eine
außergewöhnlich hohe Photostabilität besitzt. Einige TDI-Molekülen
emittieren sogar 10 11 Fluoreszenzphotonen bis zum irreversiblen
Photobleichen. Zum anderen wurde für sehr instabile
Farbstoffmoleküle eine Methode entwickelt, um durch
Bleichexperimente an einem Ensemble von Molekülen mit dem
konfokalen Mikroskop die Anzahl der emittierten Fluoreszenzphotonen
zu ermitteln. Für den Einbau in poröse Festkörper wurden daraufhin
einige Oxazinfarbstoffe und das in biologischen Untersuchungen
häufig verwendete Cy5 ausgewählt. Diese Farbstoffe können im roten
Spektralbereich anreget werden und besitzen mit etwa 10 7
emittierten Fluoreszenzphotonen eine relativ gute Photostabilität.
Als Porenstruktur wurden besonders zwei Materialien untersucht. Die
Porenstruktur AFI, die im Material AlPO4-5 vorkommt, besitzt
eindimensionale Kanäle, die hexagonal wie in einer Bienenwabe
angeordnet sind. Von diesem Material können auch regelmäßige
Kristalle hergestellt werden, die bis zu einem Millimeter lang
sind. Leider sind die Poren des AlPO4-5 mit 0,73 nm
Innendurchmesser sehr eng. Alle geeigneten Fluoreszenzfarbstoffe
sind etwas größer und werden daher in mehr oder weniger großen
Deformationen in dem Kristall eingelagert. Größere Poren besitzen
die mesoporösen M41S Materialien. In diese passen alle Farbstoffe
ohne Deformation hinein. Jedoch ist die Kristallgröße der M41S
Materialien auf wenige µm beschränkt. Mit der Methode der homogenen
Fällung können die bisher größten hexagonal geordneten MCM-41
Kristalle hergestellt werden. Zentimeter große hexagonale M41S
Festkörper (Monolithe), die durch eine Synthese mit einem
Flüssigkristall hergestellt werden, verlieren, wie hier gezeigt
wird, während der Synthese ihre eindimensionale Ausrichtung der
Poren.Beobachtete Eigenschaft des Lichtes Information aus
statischen Bestimmungen Information aus zeitabhängigen Bestimmungen
Intensität immer Notwendig Raten (Singulett, Triplett, etc.) Ort
Position Diffusion, Transport Polarisation Orientierung Drehung,
Rotation Energie Fluoreszenzspektren spektrale Diffusion Diese
verschiedenen Untersuchungsmöglichkeiten wurden aufgebaut und an
einer Referenzprobe (TDI in PMMA) getestet. Für die Datenanalyse
konnte zum Teil auf Methoden in der Literatur zurückgegriffen
werden. Es wurde darauf geachtet, daß immer eine Fehlerabschätzung
oder eine Simulation durchgeführt wurde, damit die Ergebnisse
sinnvoll interpretiert werden konnten. Oft konnten schon an der
Referenzprobe (TDI in PMMA) sehr interessante Ergebnisse erhalten
werden. So wurden z.B. neben der extrem hohen Photostabilität zwei
verschiedene Populationen der Triplettlebensdauer gemessen. Die
Position eines einzelnen TDI Moleküls konnte durch die Detektion
vieler Photonen auf besser als 1 nm bestimmt werden. Die Analyse
von zeitabhängigen Orientierungswinkeln deutet darauf hin, daß ein
TDI Molekül in PMMA noch eine sehr geringe Wackelbewegung (~1°)
ausführen kann. Bei der Analyse mehrerer 10000 Fluoreszenzspektren
von einem TDI Molekül konnten spontane Änderungen der
Fluoreszenzwellenlänge und der Schwingungskopplung beobachtet
werden. Obwohl die Messungen in den Porenstrukturen aufgrund der
geringeren Photostabilität nicht so präzise Ergebnisse liefern,
konnten auch hier interessante Beobachtungen gemacht werden. Durch
die Analyse der Orientierungswinkel vieler individueller
Farbstoffmoleküle konnte gezeigt werden, daß die einzelnen
Oxazinfarbstoffe in AlPO4-5 eine gaußförmige Verteilungsfunktion
bezüglich ihres Tiltwinkels zur Porenrichtung aufweisen. Die zuvor
erwähnten Messungen an einem Ensemble von Molekülen können die Form
der Verteilungsfunktion nicht bestimmen. Aufgrund der Kenntnis
einer gaußförmige Verteilungsfunktion kann auf ein statistisches
Einbauverhalten der Farbstoffmoleküle in Defektstrukturen während
der Synthese geschlossen werden. Auch in einem MCM-41 Kristall,
dessen große Poren jeden beliebigen Einbauwinkel des Farbstoffes
Cy5 erlauben würden, wird eine bevorzugte Orientierung beobachtet.
Der Orientierungswinkel zur Porenrichtung zeigt auch hier eine
gaußförmige Verteilungsfunktion. Interessanterweise wird bei der
frontalen Ansicht auf die hexagonale Struktur (entlang der
Bienenwabenstruktur) eine bevorzugte Orientierung auf die Flächen
des Sechsecks beobachtet. Eine Ensemblemessung kann unmöglich diese
bevorzugte Orientierung detektieren. Neben diesem statischen
Verhalten zeigen einige wenige Moleküle auch eine Änderung der
Molekülorientierung. Zwei individuelle Oxazin 1 Moleküle änderten
ihre Orientierung in AlPO4-5 während der Messung spontan. Im
Vergleich zu den anderen Oxazin 1 Molekülen besaßen diese beiden
einen ungewöhnlich großen Orientierungswinkel gegen die
Porenrichtung. Vermutlich wird die Bewegung durch einen größeren
Defekt der Porenstruktur ermöglicht. Ein TDI Molekül im Inneren
eines M41S Monolithen zeigte sogar eine mehrfache Drehung zwischen
3 verschiedenen Orientierungen.Eine Dynamik bezüglich des Ortes
zeigten einzelne TDI Moleküle im M41S Monolith. Aufgrund der
starken hydrophoben Eigenschaften des TDI kann davon ausgegangen
werden, daß sich der Farbstoff immer noch im Inneren der Mizelle
des Flüssigkristalls befindet, aus dem der Festkörper synthetisiert
wurde. Die Diffusionsbewegung kann durch eine Serie von
Fluoreszenzbilden mit dem konfokalen Mikroskop direkt verfolgt
werden. Entgegen der erwarteten eindimensionalen Diffusion, die die
hexagonale Struktur des Monolithen eigentlich erwarten läßt, wird
eine isotrope Diffusion ohne Vorzugsrichtung beobachtet (D ~ 0,04
µm 2 /s). Im reinen Flüssigkristall dagegen ist die eindimensionale
Diffusion vorhanden. Vermutlich werden die eindimensionalen Poren
bei der Synthese der festen Silikatwand so stark verknäult, daß auf
der beobachteten Längenskala ein Festkörper ohne Vorzugsrichtung
entsteht. Auch die viel langsamere Diffusion im Vergleich zum
reinen Flüssigkristall (D ~ 2 µm 2 /s) kann über diese Verknäulung
der Poren erklärt werden. Schließlich wurden noch Messungen
durchgeführt, um simultane Änderungen der Orientierung,
Fluoreszenzspektren oder Triplettraten an einem einzelnen
Farbstoffmolekül zu beobachten. Besonders die gleichzeitige
Detektion von Fluoreszenzspektren und der Orientierung lassen sich
experimentell gut durchführen. Zur Interpretation der Ergebnisse
muß hier zwischen einer starken und einer schwachen Kopplung
zwischen Gast und Wirt unterschieden werden. Bei einer polaren
Probe wird eine starke Wechselwirkung zwischen Gast und Wirt
erwartet. Diese müßte dazu führen, daß sich Änderungen in der
Orientierung auch in geänderten Fluoreszenzspektren und umgekehrt
bemerkbar machen. Bei einem geladenen Molekül wie Oxazin 1 wird
solch eine starke Kopplung des elektronischen Systems an die polare
AlPO4-5 Umgebung erwartet. Eine starke Änderung des
Fluoreszenzspektrums könnte daher von einer Umorientierung des
Farbstoffes herrühren. Bei den durchgeführten gleichzeitigen
Messungen konnte aber nur spektrale Diffusion (±1-20 nm), aber
keine gleichzeitige signifikante Umorientierung (>3°) beobachtet
werden. Eine Erklärung für dieses Verhalten könnte die Bewegung des
Gegenions des Farbstoffmoleküls sein, dessen Lage einen großen
Einfluß auf die Fluoreszenzeichenschaften hat. Eine Umorientierung
mit gleichzeitiger Detektion der Fluoreszenzspektren konnte jedoch
nicht gemessen werden. Beide Ereignisse, Umorientierungen und
spektrale Änderungen, konnten an TDI im M41S Monolith detektiert
werden. Dabei zeigte sich aber, daß es sich hier um zwei
unabhängige Prozesse handelt. Deutliche spektrale Sprünge (> 3
nm) korrelieren nicht mit deutlichen Umorientierungen (~60°). Eine
geometrische Änderung des Farbstoffmoleküls oder der näheren
Umgebung scheidet daher als Ursache für die spektrale Diffusion
aus. Da hier aber eine schwache Wechselwirkung zwischen dem
unpolaren TDI und der unpolaren Tensidumgebung vorliegt, werden
auch keine starke Änderungen der Fluoreszenzspektren während der
Umorientierung erwartet. Die spektrale Diffusion wird hier
vermutlich von kleinen diffundierenden Teilchen (z.B. O2 oder
Ionen) verursacht, die sich unabhängig von den Farbstoffmolekül
bewegen können. Die Methode der Einzelmolekülspektroskopie liefert
neue Einblicke in poröse Festkörper. Besonders durch die
zeitabhängigen Untersuchungen können Informationen erhalten werden,
die zuvor unter dem Mittelwert verborgen blieben. Ein kleiner Teil
der Arbeit beschäftigt sich mit der
Tieftemperaturfluoreszenz-spektroskopie an dem grün
fluoreszierendem Protein (GFP). Dafür wurden der Wildtyp und
verschiedene Varianten mit Mutationen in der Umgebung des zentralen
Chromophors bei 2 K untersucht. Im Vergleich zur Raumtemperatur
zeigten die Spektren bei tiefen Temperaturen deutlich mehr
Struktur. Dadurch konnten verschiedene Sub-Zustände in den
Varianten identifiziert werden. Bei fast allen Varianten konnten
durch intensive Bestrahlung langwellig absorbierende Photoprodukte
erzeugt werden, die erst bei etwa 50 bis 100 K wieder zerfallen.
Obwohl eine relativ starke Elektron-Phonon-Kopplung beobachtet
wird, ist an einigen ausgewählten Stellen auch hochaufgelöste
Tieftemperaturspektroskopie wie spektrales Lochbrennen und
Fluoreszenzlinienverschmälerung möglich. Durch
Temperatur-Ableitungs-Spektroskopie werden an Wildtyp-GFP die
Energien und Verteilungsfunktionen der Zerfallsbarrieren der
metastabilen Photoprodukte bestimmt. Schließlich wurde durch
temperaturabhängige Kurzzeitspektroskopie an Wildtyp-GFP der
'Excited state proton transfer' (ESPT) charakterisiert. Für diesen
wird bis etwa 50 K eine thermische Barriere nach Arrhenius mit
einer Aktivierungsenergie von ~2,3 kJ/mol gefunden. Unterhalb von
etwa 50 K dominiert vermutlich ein Tunnelprozeß.