Gezielte Reaktivierung spezifischer zytotoxischer T-Zellen mit Epstein-Barr-Virus-Vektoren

Die gezielte Generierung antigenspezifischer T-Zellinien, zum
Beispiel für den Einsatz in der adoptiven Immuntherapie, erfordert
die Stimulation der T-Zellen durch Kokultivierung mit anderen
Zellen, die das Antigen in einem geeigneten molekularen Kontext auf
ihrer Oberfläche präsentieren. Für den Spezialfall der Stimulation
Epstein- Barr-Virus-(EBV)-spezifischer T-Zellen existiert ein
besonders effizientes System: EBV-immortalisierte B-Zellen, genannt
lymphoblastoide Zellinien (LCLs). Solche LCLs sind leicht für jeden
beliebigen humanen Spender herzustellen und proliferieren
unbegrenzt. Sie exprimieren mehrere virale Proteine, die in vitro
wie in vivo eine starke antivirale T-Zell-Antwort hervorrufen, und
stimulieren effizient spezifische T-Zellen gegen diese
EBV-Antigene. EBV wurde genetisch modifiziert, um ein neues System
zur rationellen Generierung antigenpräsentierender Zellen für die
T-Zell-Stimulation ermöglichen. Dieses System beruht auf
rekombinanten EBV-Vektoren, mini-EBVs, in die das Gen für ein
beliebiges Antigen eingebaut wurde. Mini-EBVs immortalisieren
B-Zellen, und in den entstehenden Zelllinien, genannt mini-LCLs,
wird das gewünschte Antigen exprimiert. Zudem können mini-LCLs im
Gegensatz zu LCLs kein infektiöses EBV bilden und sind daher im
Hinblick auf einen therapeutischen Einsatz als besonders sicher
anzusehen. In dieser Arbeit sollte die Eignung von mini-LCLs
gezeigt werden, effizient ein Fremdantigen zu präsentieren, um
antigenspezifische T-Zellen zu restimulieren und expandieren.
Schwerpunkt der Arbeiten bilden Untersuchungen mit einem
mini-EBVVektor, der als Modellantigen das Gen für pp65 trägt, ein
immundominantes T-Zell- Antigen aus dem humanen Cytomegalovirus.
Die mini-EBV-Immortalisierung wurde so weit optimiert, daß
schließlich bei acht von neun gesunden Normalspendern aus einer
kleinen Blutprobe pp65mini-LCLs etabliert werden konnten. Sie waren
frei von Wildtyp-EBV, exprimierten intrazellulär pp65 und auf ihrer
Oberfläche essentielle Präsentations- und Kostimulationsmoleküle.
Durch Restimulation mit der autologen pp65mini-LCL wurden
T-Zellinien generiert. Detaillierte Zytotoxizitätsanalysen zeigten
die HLA-restringierte, pp65-spezifische Zytotoxizität der
pp65mini-LCL-stimulierten T-Zellinien aus vier von vier
CMV-seropo-sitiven Spendern. Bei allen diesen T-Zellinien
dominierte nach wiederholter Restimulation die pp65-spezifische
über die EBV-spezifische Zytotoxizität. T-Zellinien aus
EBV-seronegativen Spendern sowie Kontroll-T-Zellinien, die mit
Kontroll-mini-LCLs ohne pp65-Expression stimuliert worden waren,
zeigten dagegen lediglich eine EBVspezifische Zytotoxizität. Durch
Färbung mit HLA:Peptid-Tetrameren wurde die Expansion
pp65-epitopspezifischer T-Zellen in allen
pp65mini-LCL-restimulierten T-Zellinien aus CMV-seropositiven
Spendern nachgewiesen. Bei den drei pp65-T-Zellinien mit einer
Kultivierungsdauer von mindestens 50 Tagen, die mit Tetrameren
untersucht werden konnten, wurden 40% oder mehr
pp65-epitopspezifische CD8+-T-Zellen nachgewiesen. Auch
EBV-epitopspezifische Zellen waren nachweisbar, jedoch bestätigten
die Tetramer- Analysen, daß durch Restimulation mit pp65mini-LCLs
bevorzugt pp65-spezifische T-Zellen expandiert wurden. Der
Vergleich mit den Resultaten verschiedener aktuell publizierter
Protokolle zur invitro- Generierung pp65-spezifischer T-Zellen für
die adoptive Immuntherapie zeigt, daß pp65mini-LCLs ein
vorteilhaftes Werkzeug sein werden, um dieses Ziel zu erreichen.
Die Erweiterung des mini-EBV-Systems auf andere therapierelevante
Antigene ist die Aufgabe der Zukunft.