Einfluss von Drogenextrakten und Naturstoffen auf die endotheliale NO-Synthase

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss von
Drogenextrakten und Naturstoffen auf die endotheliale NO-Synthase
(eNOS) in humanen Endothelzellen (Primärkulturen und Zelllinien).
Insbesondere wurde dabei ihr Einfluss auf den verschiedenen
zellulären Ebenen (Transkription, Proteinexpression, NO-Synthese)
untersucht. Da es in dieser Arbeitsgruppe die erste Arbeit auf dem
Gebiet der eNOS war, mussten zunächst Methoden etabliert und
entwickelt werden, mit denen die eNOS auf den verschiedenen
zellulären Ebenen detektiert werden kann. Etabliert wurden ein
Luciferase-Reportergen-Assay zur Messung der eNOS
Promotoraktivität, eine Northern Blot-Methode zur Bestimmung der
eNOS-mRNA und eine Western Blot-Methode zur Messung der eNOS
Proteinmenge. Entwickelt wurden ein L-Arginin/L-Citrullin
Umwandlungsassay zur Bestimmung der eNOS-bedingten
L-Citrullin-produktion und ein DAF-2 Fluoreszenzassay zur Messung
der eNOS-bedingten NO-Produktion. Getestet wurden Extrakte und
Naturstoffe, bei denen bereits positive kardiovaskuläre
Eigenschaften wie Vasodilatation bekannt bzw. in der Diskussion
waren. Keinen Einfluss auf die eNOS hatten: •Knoblauchextrakte und
schwefelhaltige Knoblauchextraktinhaltsstoffe •Der Weißdornblüten-
und Blätterextrakt WS1442 •Die Catechinderivate
Epicatechin-3-gallat und Epigallocatechin-3-gallat •Die
Rotweinpolyphenole Delphinidin, Quercetin, Epicatechin und Rutin
Dagegen konnten Isoflavone der Sojabohne, wie Genistein, Daidzein,
Formononetin, Biochanin A und Equol die eNOS Promotoraktivität
konzentrationsabhängig erhöhen. Genistein (stellvertretend für alle
Isoflavone im Western Blot getestet) erhöhte auch die eNOS
Proteinmenge. Allerdings bewirkte Genistein, trotzt der Erhöhung
der Proteinmenge, keine Erhöhung der eNOS abhängigen Bildung an
L-Citrullin und NO. Positive Ergebnisse brachten die Tests mit
einem Rotweinpolyphenolextrakt (RWPE). Dieser Extrakt erhöhte
signifikant die NO-Produktion in den beiden getesteten
Endothelzellarten (EA.hy926 Zellen und HUVECs). Um den molekularen
Mechanismus der NO-Produktionserhöhung durch RWPE aufzuklären,
wurden verschiedene Ebenen der eNOS Regulation untersucht. Dabei
konnte in dieser Arbeit zum ersten mal gezeigt werden, dass RWPE
sowohl die eNOS Promotoraktivität als auch die eNOS
Proteinexpression erhöht. Die nächste Frage war, ob die
NO-Produktionserhöhung kausal mit der gemessenen
Transkriptionserhöhung zusammenhängt. Zeitabhängige Untersuchungen
auf den verschiedenen Ebenen der eNOS Regulation ergaben ähnliche
Ergebnisse mit einer signifikant messbaren Beeinflussung stets nach
ca. 10 h. Dies deutet darauf hin, dass RWPE die eNOS-abhängige
NO-Produktion über eine Erhöhung der eNOS Transkription/Translation
erhöht. Allerdings konnte dies auf Grund fehlender Experimente über
eine posttranslationelle eNOS Beeinflussung nicht eindeutig
bewiesen werden. Abschließend sollte mit der Suche nach den
wirksamen Bestandteilen im RWPE begonnen werden. Auch wenn im
Verlauf dieser Arbeit die wirksamen Verbindungen noch nicht
gefunden wurden, konnten zumindest einige Substanzen als
wirksamkeitsbestimmend oder -mitbestimmend ausgeschlossen werden.
Neben einigen nicht wirksamen Rotweinpolyphenolen (Delphinidin,
Rutin, Quercetin, Epicatechin) geben die durchgeführten Experimente
Hinweise darauf, dass auch Anthocyane, Tannine und oligomere
Procyanidine unwirksam sind. Das Stilbenderivat Resveratrol,
welches oft als eine kardiovaskulär aktive Komponente im Rotwein
angesehen wird, hatte nur einen sehr geringen und auf der Ebene der
NO-Produktion nicht signifikanten Effekt auf die eNOS.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit ein Modell zur Messung von
Einflüssen auf die eNOS aufgebaut. Von den getesteten Extrakten und
Naturstoffen beeinflusste nur RWPE signifikant die eNOS. Es konnte
erstmalig gezeigt werden, dass RWPE in Endothelzellen nach
Langzeitstimulation (20 h) die eNOS Transkription, eNOS Expression
und eNOS bedingte NO-Produktion erhöht. Dieses Ergebnis ist
physiologisch äußerst interessant. Denn bisher bekannte, die eNOS
Expression erhöhende Substanzen (z.B: Östradiol, Cyclosporin A,
Insulin, Phorbolester, Wasserstoffperoxid, Staurosporin,
Angiotensin II) sind auf Grund ihrer vielseitigen
physiologischen/toxischen Wirkungen therapeutisch zur Prophylaxe
und Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen kaum einsetzbar.
Die Aufgabe zukünftiger Arbeiten wird es sein, die Wirkung von RWPE
in vivo zu untersuchen und die für die Wirkung verantwortlichen
Bestandteile des RWPE zu finden.