Charakterisierung der funktionalen Rolle von Cytohesin-1 in der LFA-1-vermittelten T-Zell-Adhäsion

Das Leukocyten-spezifische Integrin LFA-1 spielt eine wichtige
Rolle bei der Immunantwort, durch die Vermittlung dynamischer
Zell-Zell- bzw. Zell-Matrix-Interaktionen. Die kontrollierte
Adhäsion bzw. Deadhäsion von Leukocyten bedarf einer spezifischen
Regulation des LFA-1-Integrins und die Aufklärung der molekularen
Grundlagen dieser Vorgänge ist von großem Interesse. Cytohesin-1
war unmittelbar vor Beginn dieser Arbeit als cytoplasmatischer
Regulationsfaktor der durch LFA-1 vermittelten Zelladhäsion
identifiziert worden und seine spezifische Interaktion mit der
cytoplasmatischen Domäne von CD18 konnte in vitro dokumentiert
werden. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es zunächst, die Assoziation
von Cytohesin-1 und LFA-1 auch endogen, im intakten Zellverband,
mittels Kolokalisationsstudien in der lymphoblastoiden B-Zellinie
LCL-721, zu demonstrieren. Ferner konnte mit Hilfe von
Mutationsanalysen die, für die Interaktion kritische Region in der
cytoplasmatischen Domäne von CD18 lokalisiert werden. Sie befindet
sich im aminoterminalen Bereich und umfaßt die Aminosäuren WKA(723
- 725). Die Mutation dieser Aminosäurereste nach TRG resultierte in
einem vollständigen Interaktionsverlust mit Cytohesin-1. Die
Inhibition der Cytohesin-1/CD18-Bindung konnte dabei sowohl durch
Protein-Protein-Interaktionsanalysen in Hefe als auch durch
biochemische Bindungsstudien in vitro dokumentiert werden, wobei
jeweils Fusionsproteine der cytoplasmatischen Domäne von CD18
charakterisiert wurden. Funktionale Analysen der
WKA(723-725)-Region von CD18 ergaben, daß die Mutation von
WKA(723-725) nach TRG im intakten LFA-1-Molekül eine signifikante
Reduktion der Integrin- Aktivität zur Folge hatte. Sowohl
T-Zellklone als auch nicht hämatopoetische Zellen, wie HeLa, wiesen
nach Expression von LFA-1(TRG), mit Hilfe rekombinanter Vaccinia-
Viren, eine stark reduzierte Adhäsionsfähigkeit an immobilisiertes
ICAM-1 auf. Ferner ergaben funktionale Studien mit HeLa-Zellen, die
LFA-1 stabil exprimierten, daß Cytohesin-1 nur dann eine
gesteigerte Adhäsion dieser Zellen an ICAM-1 induzierte, wenn sie
Wildtyp-LFA-1 exprimierten. HeLa-Zellen, die LFA-1(TRG)
exprimierten, ließen sich durch Cytohesin-1 zu keiner verstärkten
Adhäsion aktivieren. Diese Ergebnisse demonstrierten die
Bedeutsamkeit der Cytohesin-1/CD18-Interaktion für eine effiziente,
durch LFA-1 vermittelte Zelladhäsion. Unklar war jedoch der
Mechanismus, durch den Cytohesin-1 die Integrin/Liganden-Bindung
regulierte. Studien mit dem Reporterantikörper 24 ließen darauf
schließen, daß Cytohesin-1 durch die Bindung an CD18 eine
Konformationsänderung in der extrazellulären Domäne des
LFA-1-Integrins induzieren konnte, die möglicherweise die Affinität
des Rezeptors modulierte. Diese Modulation der LFA-1-Konformation
schien jedoch nicht hinreichend für eine stabile Bindung an ICAM-1
zu sein, wie eingehendere Analysen von Dr. W. Kolanus zeigten.
Vielmehr erforderte eine effiziente Zelladhäsion zusätzlich die
Guaninnukleotid-Austauschfunktion (GEF-Funktion) von Cytohesin-1,
da die GEF-defekte Punktmutante, Cytohesin-1(E157K), nicht mehr in
der Lage war, die Adhäsion von Jurkat E6-Zellen an ICAM-1 stabil zu
induzieren. Biochemische Interaktionsstudien konnten dabei zeigen,
daß die Mutante weiterhin fähig war, die cytoplasmatische Domäne
von CD18 zu binden. Diese und weitere Ergebnisse von Dr. W. Nagel,
die einen Zusammenhang zwischen der GEF-Funktion von Cytohesin-1
und dem „Spreading“ von adhärenten Jurkat E6-Zellen aufzeigten,
legen die Vermutung nahe, daß Cytohesin-1 durch einen dualen
Mechanismus in die LFA-1-Regulation involviert ist. Sowohl die
direkte Interaktion von Cytohesin-1 und dem Integrin als auch seine
GEF-Funktion stellen essentielle Faktoren für eine stabile
Zelladhäsion, die durch LFA-1 vermittelt wird, dar. Welche
funktionalen Mechanismen dabei durch den Guaninnukleotid-Austausch
und der damit verbundenen Aktivierung einer GTPase induziert
werden, ist noch unklar. Primär wäre eine Modulation des
Aktin-Cytoskelettes und eine damit verbundene erhöhte laterale
Mobilität der Integrine denkbar, die eine verstärkte
Rezeptormultimerisierung und dadurch eine Aviditätsänderung des
Integrins ermöglicht. Weitere Studien dieser Arbeit analysierten
die Regulation von Cytohesin-1 selbst. Es konnte gezeigt werden,
daß PI3-Kinase in die Kontrolle der Cytohesin-1-Funktion involviert
war. Die Überexpression einer konstitutiv aktiven Form dieser
Kinase (P110*) führte zu einer gesteigerten Adhäsion von Jurkat
E6-Zellen an ICAM-1. Eine Inkubation dieser Zellen mit dem
PI3-Kinase-spezifischen Inhibitor Wortmannin resultierte dagegen in
einer signifikanten Reduktion der Zelladhäsion. Weitere funktionale
Analysen, die die Zelladhäsion von Jurkat E6-Zellen nach
Koexpression von P110* und der PH-Domäne von Cytohesin-1
untersuchten, sowie eingehendere Studien von Dr. W. Nagel,
ermöglichten die Entwicklung eines Modells zur Regulation von
Cytohesin- 1. Demzufolge führt die Aktivierung der PI3-Kinase zu
einer verstärkten Rekrutierung von Cytohesin-1 an die
Plasmamembran. Als Rekrutierungsmodul fungiert dabei die PHDomäne,
die durch Bindung von PtdIns(3,4,5)P3, einem Produkt der
PI3-Kinase, die Assoziation mit der Membran gewährleistet. Die
Rekrutierung von Cytohesin-1 an die Plasmamembran führt zur
Aktivierung von LFA-1 und der damit verbundenen stabilen
Zelladhäsion an ICAM-1.