Charakterisierung des negativen Cofaktors 2 der RNA-Polymerase II in vivo und in vitro

Biochemische Untersuchungen beschreiben NC2 als einen
Transkriptionsrepressor, welcher stabil an das TATA-Box bindende
Protein (TBP) bindet. Die spezifische Bindung von NC2 an TBP
inhibiert die weitere Anlagerung der generellen
Transkriptionsfaktoren TFIIA und TFIIB und führt dadurch zur
Unterbrechung der Bildung des Initiationskomplexes. NC2 besteht aus
zwei Untereinheiten, NC2a und NC2b, die starke Homologien zu den
Histonen H2A bzw. H2B aufweisen. Alle Erkenntnisse zu Beginn dieser
Arbeit basierten auf Beobachtungen, die in vitro erhalten wurden.
Unklar sind die Funktionen von NC2 in der Zelle. Die Aufgabe dieser
Arbeit bestand darin, ein in vivo-Modellsystem zu etablieren. Als
Modellorganismus wurde die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae
ausgewählt. Hefe hat zwei Proteine, die stark homolog zum
menschlichen NC2 sind. Beide sind essentiell für das vegetative
Wachstum von Hefe. Für Plasmid-Austausch-Experimente wurden
Hefestämme konstruiert, bei denen die chromosomalen Gene für NC2a
und NC2b durch Wildtyp-Kopien auf einem URA3-Plasmid ersetzt
wurden. Mit Hilfe einer negativen Selektion gegen das URA3-Gen in
Anwesenheit von 5-FOA gelang es, die humanen NC2a- und NC2b-Gene
als episomale Kopien in Hefe stabil einzubringen. So zeigte sich
unter anderem, daß die beiden humanen NC2-Untereinheiten, sowohl
einzeln in Kombination mit ihrem Dimerisierungspartner aus Hefe als
auch gemeinsam in Form des menschlichen binären Komplexes, fähig
waren, die physiologische Funktion ihres Gegenstückes aus Hefe zu
übernehmen. Das gleiche System wurde auch eingesetzt, um
Deletionsmutanten der humanen NC2-Gene in vivo zu untersuchen. Es
wurde festgestellt, daß in beiden NC2-Untereinheiten die Domänen,
welche für die in vivo-Funktion notwendig sind, die vom Mensch zur
Hefe konservierten Regionen enthalten. Ein wesentlicher Teil dieser
Arbeit bestand darin, spontane Suppressoren einer limitierenden
NC2-Funktion in vivo zu isolieren und Suppressoren mit genomischen
Punktmutationen zu charakterisieren. Gefunden wurde eine
Punktmutation in der großen Untereinheit (Toa1) des Hefe-TFIIA,
welche einen einzigen Aminosäure-Austausch von Valin zu
Phenylalanin verursacht. Hefezellen, die diese Suppressor-Mutation
in Toa1 (mt- Toa1) tragen, weisen einen Kälte-sensitiven Phänotyp
auf und sind trotz fehlender NC2-Gene lebensfähig. Die
biochemischen Eigenschaften des rekombinanten Proteins der
Suppressor-Mutante wurden durch Gelretardations-, Footprinting- und
in vitro Transkriptionsexperimente untersucht. Das Protein mt-Toa1
war in der Lage, stabile TFIIA-Komplexe zusammen mit der kleinen
Untereinheit Toa2 auszubilden und die Rekrutierung von TBP an die
TATA-Box auf dem Promotor zu unterstützen. Allerdings zeigten
weitere Untersuchungen der Suppressor-Mutante, daß der ternäre
Komplex aus mt-yTFIIA, TBP und DNA weniger stabil ist. Hinweise
darauf gab die reduzierte Menge an Protein-DNA-Komplexen im Fall
von mtyTFIIA in Gelretardationsexperimenten unter sättigenden
Bedingungen. Das mt-yTFIIA verlor zugleich seine
Antirepressionsaktivität in in vivo-Transkriptionsexperimenten in
Anwesenheit von NC2. Die Isolierung und Charakterisierung der
Suppressor-Mutante von NC2 lieferten zum ersten Mal den Beweis, daß
die Genregulation in vivo eine präzise Balance zwischen positiv und
negativ wirkenden Aktivitäten erfordert. Gleichzeitig bestätigen
sie die in vitro Beobachtungen, insbesondere das Gleichgewicht
zwischen TFIIA und NC2 in der Kompetition um das TATA-bindende
Protein TBP. Eine weitere Aufgabe der Arbeit waren
Mutagenese-Studien von humanem NC2 in vivo und in vitro. Innerhalb
des Histone-Fold-Motives beider NC2-Untereinheiten wurden
Punktmutanten isoliert, die ihre essentielle Funktion in der
Hefezelle vollständig verloren haben. Es konnten Mutanten
identifiziert werden, die Einfluß auf das Wachstum der Hefe mit dem
Verlust der in vitro-Aktivität korrelierten. Die Charakterisierung
dieser Mutanten lieferte erste Hinweise auf funktionelle
Oberflächen von NC2, die für die ternäre Komplexbildung
(NC2-TBP-DNA) und die Repressionsfunktion wichtig sind.
Zusammengefaßt schafft die vorliegende Arbeit einen Einblick in die
NC2-Funktion in der Zelle und erweitert unser Verständnis über den
molekularen Mechanismus der Transkriptionsregulation während der
Initiation der Klasse II-Transkription.