Spektroskopie und Mikroskopie einzelner Farbstoffmoleküle im Festkörper zwischen 1,4 Kelvin und Raumtemperatur

Die spektroskopische Untersuchung einzelner Moleküle in
kondensierter Phase erstreckt sich erst über einen Zeitraum von
zehn Jahren. In dieser verhältnismäßig kurzen Zeit vollzog sich
eine rasante Entwicklung mit einer Vielzahl von Ergebnissen. Dies
findet seinen Ausdruck in eigenen Tagungen und Zeitschriften und
nicht zuletzt auch in einer Nobelkonferenz im Jahre 1999. Während
sich anfangs die Untersuchungen auf eine Reihe faszinierender
Tieftemperaturexperimente mit spektraler Selektion der einzelnen
Moleküle beschränkten, verschob sich seit Mitte der 90er Jahre der
Schwerpunkt der Forschung auf diesem Gebiet hin zu Experimenten mit
räumlicher Selektion bei Raumtemperatur, die seit kurzer Zeit auch
relativ uneingeschränkt bei Tieftemperatur möglich sind. Diese
Entwicklung spiegelt sich auch in dieser Dissertation wider. Zu
Beginn dieser Arbeit stand eine spektral hochauflösende Apparatur
zur Einzelmolekülspektroskopie bei kryogenen Temperaturen zur
Verfügung. Mit dieser wurden Einzelmoleküluntersuchungen an dem neu
synthetisierten Farbstoff Terrylendiimid (TDI) durchgeführt. TDI
ist kein reiner Kohlenwasserstoff, wie die bis dahin üblicherweise
verwendeten Chromophore, und lässt sich durch seine Seitengruppen
an andere Systeme anbinden. Er zeigt neben exzellenten
Fluoreszenzeigenschaften die zur spektralen Selektion nötigen
schmalen Absorptionslinien. Wegen seiner Struktur lässt sich TDI
nicht in einen Kristall einlagern. Mit Polyethylen und Hexadecan
wurden jedoch zwei Matrizen gefunden, die es erlauben,
Fluoreszenzanregungsspektren von einzelnen Molekülen zu
detektieren. In Hexadecan konnte bei Sättigungsuntersuchungen das
theoretisch vorhergesagte Verhalten nachgewiesen werden. Dabei
wurden Zählraten von fast 500 000 Counts pro Sekunde von einem
einzelnen Molekül erreicht. Durch die Aufnahme und Auswertung der
Fluoreszenzintensitäts-Autokorrelationsfunktion konnten die
Populations- und Depopulationsraten der Triplett-Subniveaus
bestimmt werden. Dabei wurde auch spektrale Diffusion der Moleküle
beobachtet, die mit Hilfe von Two-Level Systems (TLS) erklärt
werden konnte. Mit einem komplexen theoretischen Modell und
aufwendigen numerischen Berechnungen konnte die bei 2,5 K
auftretende Verteilung von Linienbreiten der beobachteten Moleküle
simuliert werden. Damit konnte den beiden Matrizen über die Analyse
ihrer TLS-Dichte ein unterschiedlicher Grad an Unordnung zugeordnet
werden. In temperaturabhängigen Untersuchungen der Linienform
konnte der Unterschied im Ordnungsgrad der Matrizen bestimmt
werden. Ferner konnten die Theorie von Hsu und Skinner in der
Tieftemperaturnäherung bestätigt werden und ein tieferer Einblick
in die auftretende Dynamik gewonnen werden. In der Auswertung der
temperaturabhängigen Linienverschiebung wurde erstmals der Einfluss
von Matrixexpansion berücksichtigt und als unverzichtbar für eine
gute Beschreibung des Systems erkannt. Parallel zu den ersten
Experimenten wurde eine aktive Stabilisierung des Farbsto?asers
aufgebaut. Damit konnte eine Verfälschung der Ergebnisse durch
Laserdrift ausgeschlossen werden. Weitere
Tieftemperaturuntersuchungen hatten die Beobachtung von Förster
Energietransfer (oder FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer)
an einem individuellen Donor-Akzeptor-Paar in seiner speziellen
Konformation zum Ziel. Als Farbstoffmolekül stand ein Bichromophor
aus Perylen und kovalent angebundenem TDI zur Verfügung. Obwohl
beide Chromophore sich für Einzelmoleküluntersuchungen eignen und
inzwischen schon mehrfach verwendet wurden, gelang es nicht, ein
bezüglich Linienbreite und Frequenzposition identisches
Fluoreszenzanregungsspektrum sowohl über Perylen-Fluoreszenz als
auch über TDI-Fluoreszenz (nach Energietransfer) zu detektieren.
Der Energietransferprozess scheint mit einem
Linienverbreiterungsmechanismus verknüpft zu sein, so dass eine
Beobachtung mit dem Aufbau in der Anfangsphase der Dissertation
nicht möglich war. Eine Wiederaufnahme dieser Untersuchungen mit
der neuen Apparatur ist zukünftigen Doktoranden vorbehalten. Um
allgemein temperaturabhängige Untersuchungen an fluoreszierenden
Molekülen durchführen zu können, wurde ein Tieftemperaturmikroskop
aufgebaut. Dafür wurde die Rastertechnik gewählt. Um die bekannten
Probleme des Probenscannens im Kryostaten, wie kleiner Scanbereich
und fehlender Zugang im abgekühlten Zustand, zu vermeiden, wurde
ein konfokales Laserscanning-Mikroskop entworfen und aufgebaut. Zur
Strahlablenkung wurden zwei Galvanometerspiegel gewählt und der
Drehpunkt über ein telezentrisches System in das Objektiv
abgebildet, das gemeinsam mit der Probe im Kryostaten sitzt. Die
Detektion des Fluoreszenzlichts wird von einer hochempfindlichen
Avalanche-Photodiode mit geringer Dunkelzählrate übernommen. Die
Funktion des Scanners und des gesamten optischen Aufbaus konnte an
Testmustern und Testproben erfolgreich demonstriert werden.
Einschränkend muss jedoch erwähnt werden, dass die erreichte
DetektionseŽzienz die Erwartungen nicht erfüllte. Das liegt im
Wesentlichen am Objektiv, aber auch an den Abbildungsfehlern und
Reflexionen der zahlreichen Elemente im Strahlengang. Die maximal
erreichten Zählraten lagen bei 50 000 Counts pro Sekunde am System
Terrylen in Polyethylen. Für Systeme mit einer ausreichend hohen
Fluoreszenzrate ist es mit dieser Apparatur möglich,
Fluoreszenzbilder, Zeitspuren, spektral hochauflösende
Fluoreszenzanregungsspektren, Fluoreszenzspektren und
Fluoreszenzkorrelationsfunktionen von einzelnen Molekülen
aufzunehmen, um damit spektrale und dynamische Eigenschaften der
Moleküle zu bestimmen. Durch Variation der Temperatur können die
Temperaturabhängigkeit der Messgrößen und Barrierenhöhen ermittelt
werden. Mit der neuen Apparatur wurden Untersuchungen in zwei neuen
Themenbereichenbegonnen, nämlich an einzelnen Sondenmolekülen in
Nanoporen und an den fluoreszierenden Proteinen GFP (Grün
Fluoreszierendes Protein) und PEC (Phycoerythrocyanin). Erste
Fluoreszenzanregungsspektren einzelner Terrylen-Moleküle in den
Kanalstrukturen von mesoporösen Systemen der M41S-Klasse konnten
beobachtet werden. Dabei ist die hohe spektrale Auflösung von
großem Vorteil bei der Untersuchung der spektralen Dynamik der
Sondenmoleküle. Im Bereich biologischer Proben konnten einzelne
Moleküle des Grün Fluoreszierenden Proteins isoliert beobachtet
werden. Die Anzahl an Fluoreszenzphotonen pro Molekül, die vor dem
¨Ubergang in einen Dunkelzustand an diesem System detektiert werden
konnten, war allerdings sehr gering. Deshalb wurden Untersuchungen
an einzelnen Proteinen aus dem Lichtsammelkomplex von
Cyanobakterien begonnen, die in einer laufenden Doktorarbeit von P.
Zehetmayer fortgeführt werden. Bei den Proteinproben handelt sich
um Untereinheiten von Phycoerythrocyanin: die ‹-Untereinheit und
das Trimer bzw. Monomer, in denen offenkettige
Tetrapyrrhol-Moleküle als Farbstoffe an die Proteinmatrix
angebunden sind. Neben Fluoreszenzbildern und Zeitspuren konnten
bereits Anregungsspektren detektiert werden, die starke spektrale
Dynamik zeigen und weitere Untersuchungen herausfordern.
Wesentliche Teile dieser Arbeit wurden bereits in internationalen
Zeitschriften und auf Tagungen veröffentlicht. Eine Übersicht
befindet sich am Ende unter Veröffentlichungen und Tagungsbeiträge.