Schneller Nachweis von Mutationen im gyrA Gen von Mycobacterium tuberculosis mit Relevanz für die Entstehung von Medikamentenresistenzen gegen Chinolone mittels der Real-Time PCR auf dem LightCycler System

In der vorliegenden Arbeit wurde basierend auf der genotypischen
Charakterisierung von Stämmen des Mycobacterium tuberculosis -
Komplexes anhand des gyrA-Gens mit Hilfe einer auf dem LightCycler
System basierenden gyrA Real-time-PCR ein neuartiges Testverfahren
zur Bestimmung von Chinolonresistenzen konzipiert und etabliert.
Bei der Evaluierung des Testverfahrens mit 13 phänotypisch
resistenten Stämmen mit einer MHK ≥ 4 µg/ml für Ciprofloxacin
zeigten 9 Stämme bei der Schmelzpunktanalyse einen eine Mutation
anzeigenden Shift des Tm’s, 2 weitere wiesen die typische
Schmelzkurve einer Heteroresistenz auf. Die Sequenzierung ergab,
dass 5 dieser Stämme eine Mutation des Codon 90 (AlaVal, GCGGTG)
und 6 Stämme eine Mutation des Codons 94 (AspGly, GACGGC)
aufwiesen. Die beiden verbliebenen Stämme hatten den Schmelzpunkt
des Wildtyps, der durch die Sequenzierung bestätigt werden konnte.
Die molekularepidemiologische Unabhängigkeit der resistenten Stämme
wurde durch das IS6110 Fingerprinting bestätigt. 44 phänotypisch
sensible Stämme wiesen ebenfalls den Tm des Wildtyps auf. Damit
besitzt das Testverfahren für den Nachweis von Chinolonresistenzen
eine Sensitivität von 85% und eine Spezifität von 100%. Die
Speziesspezifität wurde anhand von 7 typischen und 16 atypischen
Mykobakterien sowie humanen DNA-Präparationen und Sputumproben
überprüft, wobei sich eine Amplifikation nur bei Mitgliedern des
M.tb. - Komplexes fand. Das Testverfahren ist somit hochspezifisch
für den Mycobacterium tuberculosis - Komplex. Der Test wurde für
die Bestimmung von der Primärkultur und für den Direktnachweis aus
dem Sputum evaluiert. Der Nachweis von Mykobakterien direkt aus dem
Sputum mit dem Testverfahren ist mit 103 KBE/ml eine Größenordnung
sensitiver als die Mikroskopie. Das Testergebnis liegt in der Regel
innerhalb eines Tages vor. Für die Testdurchführung und die
Testauswertung wurden Standardprotokolle erstellt. Anhand einer
kritischen Evaluation der Primärliteratur konnte gezeigt werden,
dass eine hohe Konkordanz von über 90% zwischen höhergradigen
Chinolonresistenzen (MHK ≥ 4 µg/ml) und Mutationen des gyrA-Gens
besteht. Die Informationen aus der phänotypischen und der
genotypischen Resistenztestung sollte genutzt werden, um die beiden
Verfahren gegenseitig zu evaluieren. So sprechen die bisherigen
molekularbiologischen Daten für den von der WHO vorgeschlagenen
Grenzwert von >2µg/ml bei der phänotypischen
Resistenzbestimmung. Anhand von klinischen Studien sollte die
Grenzwertsetzung überprüft und vor allem der Nutzen der Techniken
für den Patienten evaluiert werden. Chinolone haben eine stark
zunehmende Bedeutung bei der Behandlung der Tuberkulose und werden
bisher vor allem bei der Behandlung der MDR-Tuberkulose eingesetzt.
In mehreren klinischen Studien wird derzeit auch der Einsatz von
Gyrasehemmern der neusten Generation als Standardmedikament
untersucht. Hiervon verspricht man sich insbesondere eine
Verkürzung und eine bessere Verträglichkeit der Therapie. Sollten
sich die Chinolone als First Line Medikament zur Behandlung der
Tuberkulose durchsetzten, könnte die im Rahmen dieser Arbeit
entwickelte auf dem LightCycler System basierende gyrA
Real-time-PCR aufgrund der schnellen Resistenzbestimmung innerhalb
eines Tages dem Kliniker entscheidende Hinweise für die primäre
Einleitung einer effektiven Therapie geben.