Promotor-gestützte in vivo-Markierung stabil transfizierter embryonaler Stammzellen zur Aufreinigung kardial differenzierter Subpopulationen: Ansatz zur Zelltherapie ischämischer Herzerkrankungen

Embryonale Stammzellen stellen aufgrund ihrer Fähigkeit, in vitro
in verschiedene Subtypen von Kardiomyozyten zu differenzieren, eine
vielversprechende Quelle für eine spezifische Zellersatztherapie
ischämischer Herzerkrankungen dar. Ein wesentliches Hindernis, das
große therapeutische Potenzial embryonaler Stammzellen für
klinische Zelltransplantationen zu nutzen, besteht darin, dass es
bisher kein geeignetes Verfahren gibt, den gewünschten Zelltyp zu
isolieren. Die Applikation hochaufgereinigter definierter
Subpopulationen ist jedoch Voraussetzung, um optimale funktionelle
Effekte zu erzielen und andererseits eine potenzielle
intramyokardiale Teratomformation aus mittransplantierten
undifferenzierten ES-Zellen zu vermeiden. Die Verwendung
Zelltyp-spezifischer Promotoren zur Expression eines transgenen
Oberflächenmarkers könnte die zellschonende und nicht immunogene
Aufreinigung eines gewünschten aus ES-Zellen gewonnenen Zelltyps
mit hoher Ausbeute ermöglichen und damit eine wichtige Basis für
künftige Zelltransplantationen liefern. In der vorliegenden Arbeit
wurde ein Protokoll etabliert, um mittels der magnetischen
Zellsortierung (MACS), dem gegenwärtigen Goldstandard einer
zellschonenden und effizienten Zellseparation, stabil transfizierte
murine embryonale Stammzellen aufzureinigen. Für MACS wurden
ES-Zellen markiert, die ein intrazellulär trunkiertes
CD4-Oberflächenprotein (∆CD4) unter der Kontrolle des konstitutiv
aktiven PGK-Promotors stabil exprimierten. Um die markierten Zellen
in vivo fluoreszenzmikroskopisch detektieren zu können, erfolgte in
einem Parallelansatz eine Fusion des ∆CD4 mit einem intrazellulären
EGFP-Teil (∆CD4EGFP). Die Funktionalität dieses Fusionsproteins
wurde ebenso gezeigt wie dessen Eignung für die MACS-Aufreinigung,
mit welcher Reinheiten von über 97% erzielt wurden. Die Expression
des ∆CD4-Moleküls ohne EGFP-Anteil führte nach MACS zu über 98%
positiven vitalen Zellen. Dabei waren die jeweils erzielten
Reinheiten unabhängig von dem Differenzierungszustand der Zellen
und der initialen Frequenz positiver Zellen (0,6% bis 16%). Die
Vitalität der aufgereinigten Zellen nach dem MACS-Prozess wurde
dadurch belegt, dass diese in der Lage waren, zu reaggregieren und
normale „Embryoid Bodies“ auszubilden, die Marker aller drei
embryonaler Keimblätter exprimierten. Parallel zur Etablierung der
MACS-Methode wurde der kardial spezifische humane 2,75kb
Nkx2.5-Promotor über die Expression des in vivo-Markers EGFP in
murinen embryonalen Stammzellen untersucht. Die
fluoreszenzmikroskopischen und durchflusszytometrischen Ergebnisse
korrelierten mit dem erwarteten embryonalen Aktivitätsprofil des
Nkx2.5-Promotors. RT-PCR-Analysen früher kardialer Marker zeigten,
dass der hNkx2.5-Promotor Zellen markiert, deren Expressionsmuster
dem früher kardial determinierter Zellen entspricht. Der 2,75 kb
lange hNkx2.5-Promotor bietet damit einen vielversprechenden
Ansatz, kardiale Vorläuferzellen innerhalb des heterogenen
Zellspektrums sich differenzierender ES-Zellen zu identifizieren.
Ein Transfer auf das in dieser Arbeit etablierte MACS-System könnte
die effiziente, zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung
kardialer Vorläuferzellen aus humanen ES-Zellen ermöglichen. Dieser
Ansatz könnte die Therapie ischämischer Herzmuskelerkrankungen mit
embryonalen Stammzellen der klinischen Anwendung einen
entscheidenden Schritt näher bringen.