Aufklärung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von CpG-A- und CpG-C-Oligodesoxynukleotiden als Grundlage für die Entwicklung immunstimulatorischer Nanopartikel

Hintergrund und Ziele der Arbeit: Bakterien und DNA Viren werden
anhand unmethylierter CpG-Motive innerhalb ihrer DNA von den TLR 9
tragenden PDCs und den B Zellen des humanen Immunsystems als
Gefahrensignale erkannt. Mittels synthetischer, CpG-enthaltender
ODN nutzt man diese Grundsatzmechanismen, um vergleichbare
Immunantworten auszulösen. Auf Grundlage eines unterschiedlichen
immunologischen Aktivierungsprofils wurden bislang drei CpG-Klassen
definiert: CpG-A, CpG-B und CpG-C. Mit Hilfe von CpG-A war es
erstmals möglich, IFN-α in PDCs (den endogenen Hauptproduzenten
dieses Zytokins) in Mengen zu induzieren, wie es bislang nur mit
Viren selbst möglich war. Auch CpG-C stimuliert PDCs zur Sekretion
von IFN α und aktiviert darüber hinaus B Zellen - eine Eigenschaft,
die CpG-A nicht besitzt. Die sequenzspezifischen und strukturellen
Voraussetzungen für diese differenziellen Wirkprofile waren bislang
unzureichend verstanden, auch weil die Struktur-Analysen nur
begrenzt auf die tatsächlichen Vorgänge im physiologischen Milieu
übertragbar waren. Um CpG-ODN für die therapeutische Anwendung zu
optimieren, sind die genauen Kenntnisse der
Struktur-Wirkungsbeziehungen jedoch unverzichtbar. Ein zweiter
Ansatzpunkt zur Optimierung der Anwendung liegt in der Verbesserung
der systemischen Stabilität von CpG-ODN. Die Bindung von CpG-ODN an
partikuläre Trägersysteme (z.B. Gelatine-Nanopartikel) wurde
bereits in unserer Abteiliung als mögliches drug-delivery-System
etabliert. Eine Weiterentwicklung dieses Prinzips wären partikuläre
Strukturen, die aus immunstimulatorischen Nukleinsäuren aufgebaut
keiner weiteren Trägermaterialien bedürfen. Beide Ansatzpunkte
führen zu den Zielen dieser Arbeit: 1) Die Aufklärung der
Struktur-Wirkungsbeziehungen der CpG-Klassen A und C durch
Etablierung geeigneter Methoden zur Untersuchung im physiologischen
Milieu. 2) Die Entwicklung immunstimulatorischer partikulärer
Strukturen auf Basis der in Teil 1) identifizierten wirksamen
Strukturelemente beider CpG-Klassen. Ergebnisse: 1)
Struktur-Wirkungsbeziehungen von ODN 2216 (CpG-A) und ODN M362
(CpG-C): CpG-A bildet im physiologischen Milieu spontan
multimolekulare Strukturen, deren mittlere Durchmesser mit 24 40 nm
im Größenbereich von Viren liegen. Es zeigte sich, dass für diese
Multimerisierungen das Zusammenspiel aus flankierenden
Poly-G-Motiven, palindromischem Zentrum und eingelagerten Natrium-
oder Kaliumionen entscheidend ist. Physiologisches Milieu wirkt
sich sowohl den Umgebungs-pH und die Na+/K+-Konzentrationen als
auch die Temperatur (37 °C) betreffend optimal förderlich auf die
Strukturbildung aus. Die Identifizierung dieser maßgeblichen
Faktoren machte es möglich, den Strukturaufbau von CpG-A
experimentell zu kontrollieren und die immunologischen Wirkungen
der verschiedenen Strukturen direkt zu vergleichen. Für die rasche
und hohe Induktion von IFN-α und anderen inflammatorischen
Zytokinen durch PDCs sind große Partikel verantwortlich. Die
Multimerisierungen von ODN 2216 werden bei pH < 6 zunehmend
aufgehoben. Unterbindet man die Multimerisierungen durch
Präinkubation der ODN bei Temperaturen > 60 °C oder durch Entzug
der stabilisierenden Natriumionen (indem man sie zuvor in Aqua ad
inj. löst), so verliert ODN 2216 seine immunstimulatorische
Aktivität in Bezug auf PDCs. Die schwache Wirkung der
CpG-A-Monomere kann jedoch durch Präinkubation von PDCs mit IFN β
deutlich gesteigert werden. Im Gegensatz zu den ebenfalls
einzelsträngig vorliegenden ODN 2006 (CpG-B) haben auch Monomere
von ODN 2216 keine aktivierende Wirkung auf B Zellen. CpG-C hat
durch die palindromische Sequenz die Möglichkeit, Hairpins und
Duplices zu bilden. ODN M362 zeigt jedoch keine Hairpinstrukturen.
Die Duplexformationen sind bei 37 °C in vitro nicht stabil und
spielen keine Rolle bei der durch diese ODN initiierten
B-Zell-Aktivierung. Duplices haben jedoch Anteil an der Induktion
von IFN-α in PDCs. Die in dieser Arbeit etablierten Protokolle der
Temperatur-Präinkubation ermöglichen erstmalig eine experimentelle
Kontrolle der Strukturbildungen von CpG-A und CpG-C und dadurch den
Vergleich von Struktur und Wirkung. Das Standardprotokoll für
Gelelektrophorese wurde dahingehend modifiziert, dass ein
physiologisches Milieu sowohl durch die anwesenden Ionen als auch
durch die Umgebungstemperatur (37°C) simuliert werden konnte.
2)Design Nukleinsäure-basierter Nanopartikel: Zentrale Elemente von
CpG-A und CpG-C (palindromische Sequenz, gerüstartige Verbindung
mehrerer Nukleinsäuren) wurden eingesetzt, indem ODN M362-Sequenzen
(CpG-C) an bi- und trivalenten Grundgerüsten (Linkern) für den
Strukturaufbau optimiert wurden. Trivalente Linker ermöglichen die
variierende Zusammenlagerung der palindromischen Nukleinsäuren in
drei Richtungen des Raumes und dadurch die Bildung großer Partikel.
Diese sind den bisher bekannten Maximalstimuli CpG-B und CpG-C
hinsichtlich der Aktivierung von B-Zellen gleichwertig. Erstmalig
konnten auf diese Weise B-Zellen durch partikuläre Strukturen stark
aktiviert werden. Nach Vor-Komplexierung der Partikel mit
Poly-L-Arginin wird die Aktivität bei B-Zellen nochmals verstärkt.
Kurze, nicht-palindromische CpG-DNA-Sequenzen an trivalenten
Grundgerüsten induzieren nach Vor-Komplexierung mit Poly-L-Arginin
deutlich mehr IFN-α in PBMCs als CpG-A, obwohl sie selbst nicht
multimerisieren. Wird die (palindromische) RNA-Sequenz von CpG-C an
einem trivalenten Linker verwendet, so können ebenfalls große
Strukturen generiert werden, die nach Transfektion vergleichbare
Mengen IFN-α in PBMCs induzieren wie CpG-A. Ausblick: Die
vorliegende Dissertation verbindet Fragestellungen der Immunologie
und der pharmazeutischen Technologie mit den Möglichkeiten der
Biochemie. Es werden nicht nur verschiedene Methoden zur
strukturellen Untersuchung von CpG-ODN im physiologischen Milieu
etabliert, sondern auch die experimentelle Kontrolle der
Strukturbildung von CpG-A ermöglicht. Die entwickelte Technik der
Generierung dreidimensionaler, über palindromische Nukleinsäuren
aufgebauter Partikel ist nicht auf CpG-Motive in DNA begrenzt,
sondern kann auf eine andere für Viren charakteristische
Nukleinsäure (Einzelstrang-RNA) übertragen werden. Dadurch würde
zusätzlich möglich, die immunologischen Profile von ssRNA, dsRNA
und CpG in einem Partikel zu kombinieren und die Art der
Immunantwort je nach Zusammensetzung der Partikel gezielt zu
bestimmen. Die klinische Relevanz dieser Arbeit ergibt sich aus den
neuen Erkenntnissen über die Multimerisierungen von CpG-A, welche
dessen therapeutischen Einsatz optimieren und besser
standardisierbar machen sollen. Außerdem werden neue Hinweise auf
die unterschiedlichen Aufnahme- und Erkennungsmechanismen beider
CpG-Klassen und deren Aktivierung der Synthese von IFN-α gewonnen.
Darüber hinaus wurde durch die Entwicklung der Polyvalenten Linker
eine grundsätzlich neue Technik im Stil eines Baukastensystems
etabliert, welche als Grundstein einer neuen Generation von
immunstimulatorischen Multimeren dienen soll. Die Koadministration
von Adjuvans und Antigen in direkter räumlicher Nähe bietet neue
Gestaltungsmöglichkeiten in der Vakzineentwicklung. Zudem ist zu
erwarten, dass unter Einbeziehung der RNA basierten immunologischen
Wirkprofile innerhalb eines Partikels der Einsatz von CpG-ODN zur
Therapie von Virusinfektionen und Tumoren weiter verbessert werden
kann.