Verwendung der Promotorelemente des Tumor-assoziierten Antigens EpCAM zur Genexpression in EpCAM-positiven Karzinomzellen

Das epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM ist in der
Tumorentstehung von Plattenepithelkarzinomen über- oder de novo
exprimiert. Zudem korreliert die EpCAM-Expression in Tumorzellen
positiv mit Proliferation und Entdifferenzierung. Es wurde in
Vorarbeiten ein 1100 bp epcam-Promotorfragment kloniert, das
spezifisch in EpCAM-positiven Zellen transkriptionell aktiv ist und
durch TNFα in der Promotoraktivität reprimiert wird. In meiner
Arbeit untersuchte ich, ob das 1100 bp epcam-Promotorfragment zur
gezielten heterologen Genexpression geeignet ist. Zu diesem Zweck
wurden drei Proteine ausgewählt: Grünes Fluoreszenz Protein (GFP),
TNF receptor associated death domain Protein (TRADD) und Herpes
Simplex Virus 1 Thymidinkinase (HSV1-TK). GFP diente der
Visualisierung der Promotoraktivität im Fluoreszenzmikroskop. TRADD
sollte die Apoptose in EpCAM-positiven Tumorzellen induzieren. Mit
Hilfe der spezifischen Expression der HSV1-TK in EpCAM-positiven
Zellen sollten Tumorzellen für Ganciclovir sensitiviert werden.
Eine Therapie mit Ganciclovir sollte das Absterben der Tumorzellen
bewirken. Die heterologe Genexpression wurde an einem zellulären
Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen
getestet. Dabei zeigten EpCAM-positive Zellen eine deutliche
GFP-Expression, während EpCAM-negative Zellen sporadisch eine
minimale Fluoreszenzintensität aufwiesen. Die EpCAM-spezifische
Expression von GFP konnte im Immunoblot bestätigt werden. Um den
Zusammenhang zwischen EpCAM- und GFP-Expression zu
veranschaulichen, wurden die Ergebnisse der
durchflusszytometrischen Messungen der EpCAM-Oberflächenexpression
mit der GFP-Fluoreszenz verglichen. Damit konnte im zellulären
Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen
gezeigt werden, dass die epacm-Promotoraktivität zu einer
heterologen Genexpression von GFP führt. Das zelluläre Modellsystem
von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen wurde auf die
Expression weiterer funktioneller Gene untersucht. Für das
Funktionsgen TRADD konnte dabei weder eine EpCAM-spezifische
heterologe Genexpression in der RT-PCR noch im Immunoblot
nachgewiesen werden. In beiden Untersuchungen führten die
Positivkontrollen zu einem Nachweis von TRADD. Da TRADD über
komplexe Signalwege zur Bildung von TNFα führen kann, findet
möglicherweise eine Inaktivierung des epcam-Promotors durch TNFα
statt. Die heterologe Genexpression von HSV1-TK unter der Kontrolle
des epcam-Promotors konnte im zellulären Modellsystem in der RT-PCR
nachgewiesen und auf die EpCAM-positive Tumorzelllinie SKBR3
übertragen werden. Durch die Genexpression von HSV1-TK wurden
EpCAM-positive HEK293 Transfektanten sensitiv gegenüber einer
Behandlung mit Ganciclovir und zeigten eine deutlich reduzierte
metabolische Aktivität im MTT-Ansatz bei Ganciclovirgabe. Dabei
gewonnene Erkenntnisse wurden an der EpCAM-positiven Tumorzellinie
SKBR3 bestätigt. Zusammengefasst konnte gezeigt werde, dass die
heterologe Genexpression von HSV1-TK unter der Kontrolle des
epcam-Promotors zu Ganciclovirsensitivität in EpCAM-positiven
Zellen führte, jedoch nicht in EpCAM-negativen Zellen. Somit ist es
denkbar, das 1100 bp epcam-Promotorfragment für die therapeutische
Genexpression letaler Gene zur Elimination EpCAM-positiver
Tumorzellen zu verwenden.