Phänotypische Resistenzbestimmung gegenüber HIV-1-Proteaseinhibitoren - Vergleich von DNA vs. RNA als Patientenmaterial

Das Auftreten von Resistenzen ist eines der Hauptprobleme der heute
angewandten antiretroviralen Therapie. Resistenzen können
diagnostisch mit dem sog. genotypischen oder dem phänotypischen
Verfahren festgestellt werden. Die genotypische Diagnostik beruht
auf der Nukleotid-Sequenzierung der viralen Target-Gene Reverse
Transkriptase (RT) oder Protease (PR), die relativ einfach zu
bewerkstelligen ist. Ein phänotypischer Resistenztest und damit
direkter Aktivitätstest der Enzyme RT und PR ist sehr viel
präziser. Dies ist z.B. beim Vorliegen komplexer Resistenzmuster
oder einem Mangel an genotypischer Information von
resistenzrelevanten Mutationen bei einem neu verwendeten
antiviralen Medikament von großer Bedeutung. Die zu testenden
Enzyme werden entweder aus DNA, isoliert aus PBMCs aus
Patientenvollblut oder Plasma-RNA rekombinant hergestellt. Vor
kurzem wurde nun die Frage erhoben, ob die diagnostisch gemessenen
Werte Unterschiede aufweisen, je nachdem ob DNA oder RNA als
Ausgangsmaterial verwendet wurde. Die Veröffentlichungen zu diesem
Thema waren diskreptant in ihren Aussagen. Zur Klärung dieser Frage
wurde in der vorliegenden Arbeit das phänotypische
Resistenzverhalten der HIV-Protease von 12 Patienten gegenüber 5
verschiedenen Proteaseinhibitoren untersucht. Aus jedem der
Patienten wurde ein "Protease-Paar" sowohl aus HIV-DNA als auch
HIV-RNA (via cDNA) rekombinant produziert. Die Patienten wiesen
eine unterschiedliche Höhe der Viruslast auf, sie lag zwischen
1.900 cp/ml und 230.000 cp/ml, und hatten unterschiedlich hohe
CD4-Zellzahlen. Mit dieser Untersuchung sollte also erstens die
Frage beantwortet werden, ob zu einem gegebenen Zeitpunkt
Abweichungen im Resistenzprofil zwischen den beiden Formen
genetischer Information von HIV im Körper vorliegen können. Im
positiven Fall sollte festgestellt werden, welchen Einfluss die
Virusvermehrung/Virusdynamik und der Immunstatus des betroffenen
Patienten, ausgedrückt durch die Laborparameter Viruslast und
CD4-Zellzahl, darauf haben. Zweitens sollte dasjenige
Probenmaterial gefunden werden, welches für den phänotypischen
Resistenztest das optimale Resultat ergibt: entweder HIV-DNA aus
PBMCs im Vollblut oder HIV-RNA aus Blutplasma. Der hier verwendete
phänotypische Resistenztest (PRT) basiert auf der direkten Messung
der HIV-Proteaseaktivität, die durch rekombinante Expression der
gesamten Population von HIV-Protease eines Patienten hergestellt
wurde. Für die vorliegende Arbeit wurde parallel sowohl HIV-DNA aus
PBMCs im Vollblut als auch cDNA aus viraler RNA im Blutplasma des
Patienten als Ausgangsmaterial für die nested PCR verwendet. Nach
erfolgter Expression des Enzyms in E. coli und effektiver
Ein-Schritt-Aufreinigung wurde die Proteaseaktivität mit einem
neuen und schnellen phänotypischen Testsystem mittels eines
Fluoreszenzsubstrates in Ab- und Anwesenheit der verschiedenen
Inhibitoren gemessen. Durch den Vergleich mit Wildtyp-Werten
konnten die entsprechenden Resistenzfaktoren berechnet werden.
Ergebnis: Von den 12 untersuchten Patienten zeigten sich in 3
"DNA/RNA-Paaren" signifikante Unterschiede in mindestens einem
Proteaseinhibitor, während bei 9 Patienten übereinstimmende
Resistenzmuster gefunden wurden. Schlussfolgernd wird festgestellt,
dass die Verwendung von entweder DNA oder RNA als Ausgangssubstanz
für den benutzten Resistenztest unterschiedliche Ergebnisse im
Resistenzmuster erbringen kann, dies aber nicht notwendigerweise
der Fall ist. Zwischen dem Auftreten bzw. Fehlen von
unterschiedlichen Resistenzmustern und den virologischen und
immunologischen Parametern Viruslast und Anzahl der CD4 positiven
Zellen konnte keine klare Korrelation festgestellt werden. Ein
Auftreten von Differenzen zwischen den Resistenzmustern von DNA und
RNA kann die Folge eines Populationswechsels der HIV-RNA sein, die
im Gegensatz zur archivarischen Natur der meist integrierten DNA
aus ruhenden CD4 positiven T-Gedächtniszellen oder Monozyten erst
kürzlich von aktiv infizierten Zellen produziert wurde. Ein Fehlen
von Unterschieden kann bedeuten, dass die Hauptfraktion der DNA
entweder erst kürzlich generiert wurde oder die RNA sich nicht
verändert hat. Für die diagnostische Anwendung des PRT haben diese
Ergebnisse folgende Konsequenzen: um die aktuelle
Resistenzsituation abzubilden, ist virale RNA aus dem Blutplasma
das bevorzugte Ausgangsmaterial. Um dagegen stille Mutationen
aufzudecken, die z.B. für zukünftige Therapien oder eine adäquate
Postexpositionsprophylaxe von Bedeutung sind, sollte virale DNA,
stammend aus PBMCs des Vollblutes, verwendet werden.