Optimierung Adeno-assoziierter Viren als Vektoren für die Gentherapie solider Tumoren

Tumorerkrankungen stellen die zweithäufigste Todesursache in den
Industrieländern nach den kardiovaskulären Erkrankungen dar. Trotz
moderner Therapien verlaufen diese Erkrankungen vor allem im
fortgeschrittenen Stadium immer noch häufig letal. Es besteht also
Bedarf neue, innovative Therapieansätze zu verfolgen und zu
optimieren. Die Gentherapie ermöglicht die Umsetzung attraktiver
Strategien zur Behandlung von Tumorerkrankungen. Solche Strategien
basieren entweder auf einem Gentransfer in Tumorzellen mit dem Ziel
diese so zu modifizieren, dass sich daraus ein anti-Tumor Effekt
ergibt (Überexpression immunmodulatorischer Faktoren, Suizidgene),
oder auf der systemischen Überexpression solubler Faktoren, die zu
einer Hemmung des Tumorwachstums führen (z. B. antiangiogene
Faktoren). Solche Ansätze konnten in jüngster Zeit erfolgreich in
Tiermodellen umgesetzt werden. Ergebnisse aus klinischen Studien
sind demgegenüber bislang enttäuschend ausgefallen. Limitationen
der verwendeten Vektorsysteme werden dafür verantwortlich gemacht.
Daher ist die weitere Optimierung der Vektorsysteme von
entscheidender Bedeutung. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich
mit der Optimierung des Tumor-Gentransfers in soliden Tumoren
basierend auf dem Adeno-assoziierten Virus (AAV). AAV ist ein
einzelsträngiges DNS-Virus. Auf dem Weg zur Transgen-Expression
stellt die Doppelstrangsynthese einen wesentlichen limitierenden
Schritt dar. In dieser Arbeit wurden modifizierte AAV-Vektoren, die
primär eine doppelsträngige DNS zur Verfügung stellen, im Hinblick
auf die Effizienz des Tumor-Gentransfers unter in vitro-
Bedingungen systematisch untersucht. Es wurden dazu AAV-Vektoren
hergestellt, die primär eine doppelsträngige DNS zur Verfügung
stellen. Es konnte gezeigt werden, dass bei Verwendung von
doppelsträngigem AAV (dsAAV), bei dem etwa 10 % der Vektoren einer
Präparation doppelsträngige DNS aufweisen, die Transduktionsrate in
soliden Tumorzelllinien bis auf das 4-fache erhöht werden kann.
Durch die Verwendung eines self-complementary AAV (scAAV) Vektors,
bei den in über 90 % Viren generiert werden, die eine
doppelsträngige DNS aufweisen, konnte die Transduktionsrate weiter
bis auf das bis zu 17-fache gegenüber konventionellen
einzelsträngigen AAV gesteigert werden. Der Abbau von AAV über
Proteasomen wurde in Epithelien der Atemwege als ein Faktor
charakterisiert, der für eine Verminderung der
Gentransfer-Effizienz verantwortlich ist. In dieser Arbeit konnte
durch Einsatz eines Proteasomen-Inhibitors (MG132) gezeigt werden,
dass dieser Mechanismus auch für den Gentransfer in Tumorzellen
eine wichtige Rolle spielt. Dies trifft vor allem für die
Tumorzelllinien zu, die durch MG132 nicht in die Apoptose getrieben
werden. In vitro konnte somit durch kombinierte Verwendung von
scAAV sowie MG132 der Tumor-Gentransfer in bestimmten Zelllinien
-wie zum Beispiel in der Kolonkarzinom-Zelllinie HT29 um den Faktor
20- verbessert werden. Bei der Anwendung der modifizierten
AAV-Vektoren in einem HeLa-SCID-Mausmodell zeigte sich aber eine
deutliche Abnahme der Gentransfer-Effizienz unter in
vivo-Bedingungen. In vergleichenden Experimente an Tumor-Spheroiden
von HeLa-Zellen und einer humanen Neuroblastom-Zelllinie wurde
herausgearbeitet, dass die extrazelluläre Matrix (ECM) eine
hemmende Rolle beim AAV-vermittelten Gentransfers in HeLa-Spheroide
ausübt, während sie beim Gentransfer in Tumoren neuronalen
Ursprungs (Neuroblastom) signifikant geringer ausfällt. Um AAV als
Vektor für den in vivo Tumor-Gentransfer einsetzen zu können,
müssen Strategien gefunden werden, um die Barriere, die durch die
extrazelluläre Matrix gegeben ist, zu überwinden. Ein Targeting der
Vektoren, das heißt, eine gezielte Veränderung des natürlichen
Tropismus der Viren, stellt dazu einen attraktiven Lösungsansatz
dar.