Systematische Analyse zyklusabhängiger Veränderungen des Transkriptoms im bovinen Eileiterepithel

Der Eileiter spielt eine bedeutende Rolle im Reproduktionsgeschehen
und ist dabei in viele wichtige Prozesse involviert. Er unterstützt
durch das Milieu, das er bereit stellt, die Kapazitation der
Spermien, die Reifung und die Befruchtung der Eizelle, und er
fördert durch sezernierte Faktoren die frühe Embryonalentwicklung.
Während des Zyklus durchläuft er deutliche morphologische und
histologische Veränderungen, um seinen verschiedenen Aufgaben
gerecht zu werden. Da viele Veränderungen in einem Gewebe mit einer
Veränderung des Transkriptoms einhergehen, haben wir bovines
Eileiterepithel als Ausgangsmaterial für Untersuchungen auf der
Ebene der mRNA ausgewählt. Um ein homogenes und definiertes
Probenmaterial erhalten zu können, musste die Schlachtung der Tiere
zur Probengewinnung zu einem möglichst genau definierten
Zykluszeitpunkt stattfinden. Hierfür wurde ein Protokoll zur
Tiervorbereitung erarbeitet, mit dessen Hilfe alle Tiere für die
Versuche einheitlich ausgewählt und zyklussynchronisiert wurden.
Weiterhin wurde ein Entnahmeprotokoll für die Eileiterepithelproben
entwickelt, das Schwankungen in der Probenqualität unabhängig von
der durchführenden Person minimiert. Zur Untersuchung von
Veränderungen des Transkriptoms wurde in einem ersten Ansatz eine
Kombination aus subtraktiven cDNA-Banken und radioaktiver
cDNA-Array-Hybridisierung verwendet. Zuerst wurde Eileiterepithel
(Ampulle und Isthmus gemeinsam) von drei Tieren im Östrus und drei
Tieren im Diöstrus untersucht. Insgesamt wurde die Expression von
3072 cDNA-Klonen (1536 cDNAs pro subraktiver Bank, eine Bank pro
Zykluszeitpunkt) im Östrus versus Diöstrus verglichen. Dabei
konnten 77 verschiedene cDNAs mit signifikanten
Konzentrationsunterschieden zwischen den beiden Zykluszeitpunkten
identifiziert werden. Davon waren 37 im Östrus und 40 im Diöstrus
stärker exprimiert. Die identifizierten Gene wurden in
Funktionsklassen eingeordnet. Dadurch konnten vereinfachte „Gene
Ontologies“ gebildet werden, die einen Überblick geben, welche
biologischen Prozesse und molekularen Funktionen zwischen Östrus
und Diöstrus reguliert werden. So sind Gene, die für die Synthese
und Sekretion von Proteinen wichtig sind, im Östrus hochreguliert,
wohingegen Gene, die Aufgaben in der Regulation der körpereigenen
Immunantwort und der Transkription haben, im Diöstrus hochreguliert
sind. In einem zweiten Ansatz wurden die gewonnenen Einblicke in
die Genexpressions-veränderungen während des Zyklus weiter
vertieft. Dazu wurde ein Ovidukt-Array hergestellt, das auf
vorangegangene Arbeiten zur Genexpression im Eileiterepithel
aufbaute und durch alle cDNAs, die im Vergleich von Eileiterepithel
im Östrus zu Diöstrus als differenziell exprimiert auffielen sowie
durch einige Kandidatengene, erweitert wurde. Zusätzlich enthielt
es, als interne Kontrolle, 94 cDNAs, von denen keine Veränderung
der Genexpression im Zyklusverlauf zu erwarten waren. Auf dem
Ovidukt-Array befanden sich insgesamt 549 cDNAs von 432 Genen. Mit
diesem Array wurden Hybridisierungs-experimente mit bovinen
Eileiterproben aus vier verschiedenen Zyklusstadien durchgeführt,
jeweils drei Tiere an Tag 0, Tag 3,5, Tag 12 und Tag 18 des
Sexualzyklus. Dabei wurden Proben aus Ampulle und Isthmus getrennt
voneinander untersucht. Die Auswertung der
Hybridisierungsergebnisse ergab 196 differenziell exprimierte Gene.
Die mit den Ovidukt-Array erhaltenen Daten konnten die beim
Östrus-Diöstrus-Vergleich erhaltenen Ergebnisse sehr gut
bestätigen, weiter vertiefen und spezifizieren. Zusätzlich wurden
Veränderungen der mRNA-Spiegel ausgewählter Gene durch quantitative
Real-time RT-PCR genauer quantifiziert und Lokalisationsstudien im
Eileiterepithel mittels in situ Hybridisierung durchgeführt.
Weiterhin wurde damit begonnen, Veränderungen auf Proteinebene in
den Eileiterepithelzellen im Zyklusverlauf für einzelne
Kandidatengene zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit ergab
grundlegende Erkenntnisse zur Veränderung der mRNA-Zusammensetzung
während des Sexualzyklus im bovinen Eileiterepithel aus der Ampulle
und dem Isthmus. Damit wurden histologische Veränderungen des
Epithels während des Zyklus auf molekularer Ebene charakterisiert.
Auf dieser Grundlage können auch spezifische Reaktionen, die von
anwesenden Spermien, befruchteten Eizellen oder Embryonen ausgelöst
werden, untersucht werden.