Entwicklung und Charakterisierung von Enzymimmuntests für den Nachweis von Fluorchinolonen

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung
enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis von in der EU-weit
geltenden Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 reglementierten Chinolonen.
Zur Gewinnung gruppenspezifischer Antikörper wurde
Ciprofloxacin-Ethylendiamin an Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH)
gekoppelt und drei Kaninchen intracutan immunisiert. Nach einer
Restimulierung waren bei allen drei Kaninchen spezifische
Antikörper nachweisbar. Die zur Erstellung eines direkten und
indirekten kompetitiven enzymimmunologischen Nachweisverfahrens
notwendigen markierten Antigene wurden durch Kopplung von
Ciprofloxacin, Ciprofloxacin-Ethylendiamin, Clinafloxacin sowie
Norfloxacin an Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase oder Ovalbumin
hergestellt. Dabei kamen verschiedene Kopplungsmethoden (aktive
Estermethode, Perjodatmethode und Carbodiimidmethode) zum Einsatz.
Mit dem spezifischen Serum eines Tieres wurden verschiedene
kompetitive Enzymimmun-testsysteme entwickelt. Von den direkten
Enzymimmuntests wies das empfindlichste System eine Nachweisgrenze
für Ciprofloxacin von 1,25 ng/ml auf, im indirekten Testsystem lag
die untere Nachweisgrenze bei 1,5 ng/ml. Ciprofloxacin konnte somit
weit unterhalb des geltenden MRL-Wertes von 100 µg/kg in Milch
nachgewiesen werden. Das Antiserum zeigte nur bedingt
Gruppenspezifität. Für fünf von 23 überprüften Chinolonen wurden
Kreuzreaktionen von > 50 % ermittelt, von den mit einem MRL-Wert
belegten Substanzen wurden Danofloxacin, Ciprofloxacin,
Enrofloxacin und Oxolinsäure erfasst. Zur Überprüfung der
Anwendbarkeit der entwickelten Testsysteme wurden künstlich
kontaminierte und gewachsene Milch- und Garnelenproben untersucht,
wobei das jeweilige Testsystem an die entsprechende Probenmatrix
adaptiert wurde. Die mittlere Wiederfindungsrate lag bei 95,5 %, in
keiner der Praxisproben konnten Chinolonrückstände nachgewiesen
werden. Weiterhin wurde ein mikrobiologisches Verfahren unter
Verwendung von E. coli als Testkeim zum Nachweis für Chinolone
entwickelt. Dieser Agardiffusionstest zeichnete sich durch eine
hohe Sensitivität und Gruppenspezifität aus. Ciprofloxacin konnte
mit einer Nachweisgrenze von 2 ng/ml weit unterhalb des geltenden
MRLs nachgewiesen werden, zehn weitere wichtige Chinolone wurden
unterhalb von 100 ng/ml erfasst. Dieses System kann somit als
nützlicher Kontrolltest verwendet werden.