Amino acid analysis in biofluids using LC-MS/MS

Klinische Studien zeigen, dass die Zusammensetzung von
zirkulierenden, freien AS im Blut, ein Marker für monogene und
multigenetische Krankheiten ist. Die Analyse von hohen
Probandenzahlen in klinischen Studien wird oftmals durch aufwendige
und lange Probenaufarbeitungsschritte begrenzt. Im Rahmen der
Metabolomics Plattform, die im Dr. von Haunerschen Kinderspitals
etabliert wurde, wurde eine Hochdurchsatzmethode entwickelt, die
eine selektive, sensitive, präzise und robuste Quantifizierung von
22 AS aus kleinen Probenvolumina ermöglicht. Im Laufe der Zeit
konnten noch weitere Aminosäuren zur Methodik hinzugefügt werden.
Dabei können innerhalb von 36 Stunden 96 Proben analysiert werden.
Mit Hilfe eines deuterierten, interenen Standards in methanolischer
Lösung werden Proteine aus nur 10 μL Probenvolumen gefällt. Zur
Quantifizierung der AS wird anschliessend der eingedampfte
Überstand derivatisiert und in Kombination mit einem Ionen-Paar-
Reagenzes chromatographiert. Der Methodenaufarbeitung liegt eine
umfassende und ausführliche Validierung zugrunde, die einer
Interday Precision von 3.1 -10.8 % für alle Analyten erzielt.
Zusätzlich unterzieht sich unsere Methode jedes Jahr an einem
Ringversuch, der eine exakte Bestimmung aller Analyten
gewährleistet. Im Zusammenhang mit der Programmierung des
Stoffwechsels durch die Ernährung im Säuglingsalter wurde die neu
entwickelte AS-Methode zur Quantifizierung von 726 Serum Proben in
einer randomizierten klinischen Studie eingesetzt. Dabei wurde der
Bezug zwischen Proteinzufuhr (Formelnahrung mit hohem Eiweißanteil
bzw. niedriegem Eiweißanteil) und AS-Profil bei 6 Monate alten
Säuglingen analysiert. Eine signifikante Veränderung der
Plasmakonzentrationen zeigte sich in der Gruppe der formelernährten
Kindern mit hohem Proteinanteil für folgende AS: BCAA, Gly, Lys,
Met, Phe, Pro, Thr, Trp und Tyr. Essentielle AS werden über die
Nahrung aufgenommen und vermutlich über das L-Transportsystem in
die Zirkulation freigesetzt. Im Vergleich dazu werden nicht
essentielle AS im Darm katabolisiert und mit Hilfe der de novo
Synthese in gleichbleibenden Konzentrationen reguliert, sodass kein
signifikanter Unterschied in beiden Gruppen beobachtet wurde. Durch
eine proteinreiche Nahrung können AS vermehrt an der Aktivierung
von Wachstumshormonen (mTOR, IGF-1) teilhaben, was sich im
vermehrten Zellwachstum und –proliferation manifestiert. Nichts
desto trotz kann die vermehrte Wachstumshormonaktivierung
Krankheiten wie Insulinresistenz, Diabetes oder auch Übergewicht
hervorrufen. Aufgrund des erhöhten Krankheitsrisikos ist einerseits
von einer proteinreichen Ernährung im frühen Säuglingsalter
abzuraten, andererseits kann das Stillen bzw. eiweißänhnliche
Brustmilchzusammensetzung gesundheitsunterstützend sein. Auch im
Rahmen eines Supplementierungsprojektes bei Kühen, hat sich die neu
entwickelte AS-Methode bewährt. Dazu wurden jeweils 10 Kühe kurz
vor und nach der Geburt mit CLA (CLA-Gruppe) oder mit Linolsäure
(Kontroll-Gruppe) supplementiert. Ziel der Studie war es, den
Zusammenhang zwischen CLA Supplementierung und AS- Profil im Blut
zu analysieren. Dazu wurden zu insgesamt 8 Zeitpunkten vor und nach
der Geburt, Blutproben entnommen. Es kristallisierten sich 3
verschiedene Zeitverläufe heraus, wobei die meisten
AS-Konzentrationen nach der Geburt abfallen und langsam wieder auf
ihre Ausgangswerte ansteigen. AS wie Glu sinken vor der Geburt
stark ab, was dafür sprechen könnte, dass der Fetus mit ausreichend
Glu versorgt wird und nach der Geburt vermehrt in die Milch
transportiert wird. Gly, HPro, MHis und Ser steigen bis zur Geburt
an und fallen dann wieder ab wobei Mhis durch den
Muskelproteinabbau keinen Konzentrationsanstieg in den ersten 12
Laktationswochen erfährt. Die Supplementierung mit CLA zeigte
keinen signifikanten Unterschied beider Gruppen auf das AS-Profil
und zeigte somit keine Auswirkungen auf die AS-Synthese.