Interaktionen zwischen löslichen Komponenten des flagellenspezifischen Typ III-Sekretionssystems von Escherichia coli K12

Für die Assemblierung des bakteriellen Flagellums müssen die
externen Untereinheiten an ihren Bestimmungsort transportiert
werden. Dies geschieht wie bei allen Gram-negativen Bakterien auch
in Escherichia coli mit Hilfe des flagellären Typ
III-Sekretionssystems (fTTSS). Dabei ist der flagelläre
Exportapparat mit seinen cytoplasmatischen Komponenten FliH, FliI
und FliJ von Bedeutung. Der Exportapparat ist im Basalkörper des
Flagellums lokalisiert und liefert die Energie für den Export der
Substrate, wie z. B. das Hakenkappenprotein FlgD und das
Hakenprotein FlgE. Die Substrate benötigen ihrerseits ein Signal
für die Erkennung durch den Exportapparat. Im Rahmen dieser Arbeit
konnten Interaktionen zwischen den löslichen Komponenten FliH, FliI
und FliJ des flagellären Typ III-Sekretionssystems von E. coli K12
festgestellt werden. Zudem wurden begonnene Arbeiten zur
Lokalisation und Beschaffenheit einer Erkennungssequenz für den
Exportapparat beim Substrat FlgD weitergeführt und auch das
Substrat FlgE näher untersucht. Mit Hilfe der
Affinitätschromatographie konnte ein Komplex, bestehend aus FliH,
FliI und FliJ, aus dem Cytosol von E. coli BL21 (DE3) präpariert
werden. Dafür wurden zuvor die Gene fliH, fliI und fliJ zusammen in
den Vektor pASK-IBA 45 kloniert und dann exprimiert. Parameter für
Interaktionen und Affinitäten zwischen zuvor einzeln präpariertem
FliH, FliI und FliJ konnten mit Hilfe von isothermaler
Titrationskalorimetrie (ITC) und Surface Plasmon Resonance (SPR)
ermittelt werden. Unter Verwendung eines bereits etablierten
Testsystems für das fTTSS in E. coli CC181-Mutanten konnte der
Export der Hybridproteine FlgDPhoA bzw. FlgEPhoA untersucht werden.
Dabei wurden von FlgD auch N- oder C-terminale Verkürzungen sowie
auf Nukleotid- oder Aminosäureebene veränderte Sequenzen
eingesetzt. Die Untersuchungen ergaben ein Signal für den Export
des Hakenkappenproteins FlgD auf Proteinebene und nicht auf der
Ebene der mRNA. Zudem konnte das Exportsignal auf die N terminalen
71 Aminosäuren von FlgD eingegrenzt und eine Bedeutung des
möglichen zweiten Startcodons an Position 52 in flgD für den Export
ausgeschlossen werden. FlgE wurde in seiner gesamten Länge vom
fTTSS transportiert. Im Gegensatz zu FlgD führten jedoch alle
C-terminalen Verkürzungen von FlgE zum Transportverlust.