Untersuchung molekularer Mechanismen der EBNA-2 vermittelten Transaktivierung

Zusammenfassung Das Epstein-Barr Virus nukleäre Antigen 2 (EBNA-2)
ist ein Schlüsselprotein bei der Initiation und der
Aufrechterhaltung der B-Zelltransformation nach einer
EBV-Infektion. EBNA-2 reguliert die Genexpression von viralen und
zellulären Genen und induziert so das physiologische
Proliferationsprogramm der B-Zelle. Die DNA-Bindung erfolgt
indirekt durch eine Interaktion mit zellulären Adapterproteinen, zu
denen das CBF1 (C-promoter binding factor 1) Protein zählt. Mit
dieser Arbeit sollte ein Beitrag zum Verständnis der bisher wenig
untersuchten molekularen Mechanismen, über die EBNA-2 zelluläre
Zielgene transaktiviert, geleistet werden. Die drei zellulären
EBNA-2-Zielgene SLAMF1, DNASE1L3 und CCL3 wurden in dieser Arbeit
exemplarisch untersucht. Die EBNA-2-Transaktivierung der drei Gene
ist CBF1 abhängig. In allen drei Genen konnte erstmals eine
EBNA-2-Bindung am Transkriptionsstart nachgewiesen werden.
Erstmalig ist auch der Nachweis gelungen, dass EBNA-2 an
intronständige CBF1-Bindestellen rekrutiert wird. Eine
EBNA-2-Aktivierung führte in allen untersuchten Genen zur
Rekrutierung der an Serin 5 phosphorylierten Polymerase II an den
Transkriptionsstart, sowie auch zu CBF1-Bindestellen in Regionen,
die distal zum Transkriptionsstart lokalisiert sind. Die
Aktivierung der Genexpression korreliert in allen Fällen mit einer
erhöhten Acetylierung der Histone H3 und H4, die nicht auf den
Bereich des Transkriptionsstarts beschränkt war. Eine detaillierte
Analyse des CCL3-Gens erwies, dass die DNA-Bindung von CBF1 durch
EBNA-2 unterstützt wird. Des Weiteren zeigte sich, dass eine nahe
dem Transkriptionsstart gelegene Region entscheidend zur EBNA-2
vermittelten Transaktivierung beiträgt und vermutlich nicht durch
CBF1 vermittelt wird. Möglicherweise reguliert EBNA-2 nicht nur
über eine Bindung an CBF1 die Transaktivierung eines Genes, sondern
noch über einen zweiten Mechanismus, bei dem EBNA-2 direkt oder
indirekt an den Transkriptionsstart oder in dessen unmittelbarer
Nähe bindet. Zur Identifikation von Proteinen, die direkt an dem
molekularen Mechanismus der EBNA-2-Transaktivierung beteiligt sind,
wurde die „Tandem Affinity Purification“ (TAP-Reinigung) zur
Aufreinigung nativer EBNA-2-Komplexe in B-Zellen etabliert. Durch
eine anschließende massenspektrometrische Analyse konnten
potentielle EBNA-2-Interaktionspartner identifiziert werden. Für
das interessante Kandidatenprotein TFE3, ein Transkriptionsfaktor
des Immunglobulinlokus, konnte bereits eine spezifische
Anreicherung über EBNA-2 nachgewiesen werden.