Interaktionen des humanpathogenen Schimmelpilzes Aspergillus fumigatus mit Wirtszellen

Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Krankheitserreger,
der ubiquitär in der Umwelt vorhanden ist. Die schwerwiegende
Krankheit, die er verursacht, ist die invasive Aspergillose, welche
nur bei immungeschwächten Patienten auftritt und bis heute nur sehr
schwierig zu diagnostizieren und zu heilen ist. Die Sporen von A.
fumigatus können aufgrund ihrer geringen Größe bis in die Alveolen
der Lunge gelangen. Dort bilden Makrophagen die erste
Verteidigungslinie, indem sie die Sporen phagozytieren. Die
Phagozytose ist Bestandteil der angeborenen Immunantwort und ein
initialer Schritt bei der Bekämpfung von A. fumigatus-Sporen durch
Makrophagen. Das Verstehen dieses Prozesses gewinnt durch die
stetige Zunahme der Patienten mit invasiver Aspergillose immer
größere Bedeutung und ist Gegenstand intensivster Forschung. Im
Rahmen dieser Dissertation wurden die Interaktionen von murinen und
humanen Makrophagen mit A. fumigatus-Sporen untersucht. Die
Fragestellung wurde aus zwei unterschiedlichen Perspektiven
betrachtet. Zum einen wurde die Oberfläche der A. fumigatus-Sporen
analysiert; zum anderen wurden die Interaktionen von A. fumigatus
mit phagozytierenden Zellen erforscht. Um die Phagozytose von A.
fumigatus-Sporen in murinen und humanen Zellen genauer
charakterisieren zu können, wurde in dieser Arbeit der so genannte
„Biotin-Calcofluor Staining Assay“ (BCS-Assay) entwickelt. Mit
Hilfe dieser Methode war es möglich, zwischen extra- und
intrazellulären Sporen zu unterscheiden, ohne auf die Anwesenheit
von Antikörpern angewiesen zu sein. Mit Hilfe von diversen
Inhibitoren konnte der Mechanismus der Phagozytose genauer
untersucht werden. So konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von
A. fumigatus-Sporen ein Aktin-abhängiger Prozess ist und dass
Makrophagen für die Phagozytose die Aktivierung der Phosphoinositid
3 Phosphat-Kinasen und von Tyrosin-Kinasen benötigen, insbesondere
diejenigen der scr Familie. Butanedion Monoxim, ein Inhibitor der
Myosinmotor-Aktivität, blockierte ebenfalls effizient die
Sporenaufnahme. Die weiteren Untersuchungen der Phagozytoseprozesse
von A. fumigatus-Sporen erfolgten u.a. mit Hilfe von Fluoreszenz-
und elektronenmikroskopischer Aufnahmen. In der Immunfluoreszenz
ließen sich Tyrosin-phosphorylierte Proteine in den
Aufnahmestrukturen detektieren, und elektronenmikroskopische
Aufnahmen infizierter Makrophagen zeigten so gennante
„Ruffle“-Strukturen. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass A.
fumigatus-Sporen durch einen „Trigger“-ähnlichen Mechanismus
aufgenommen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die
Rezeptoren der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen charakterisiert.
Die Ergebnisse von Meier und ihren Kollegen zeigten bereits, dass
die Erkennung von A. fumigatus durch Makrophagen mittels Toll-like
Rezeptor 2 und TLR4 erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde nun
auch der Frage nachgegangen, welche Rolle TLR2 und TLR4 bei der
Phagozytose von A. fumigatus-Sporen spielen. Hierzu wurden aus den
Mausstämmen C3H/HeN (WT), C3H/HeJ (TLR4-), C3H/HeN TLR2-/- (TLR2-)
und C3H/HeJ TLR2-/- (TLR2-/4-) murine Peritonealmakrophagen mittels
Peritoneallavage entnommen, mit A. fumigatus-Sporen infiziert und
mit Hilfe des BCS-Assays ausgewertet. Es konnte gezeigt werden,
dass Toll-like Rezeptor 2 und nicht Toll-like Rezeptor 4 für eine
effiziente Phagozytose benötigt wird. Dieses Ergebnis ließ sich
wiederum mit Hilfe eines anti TLR2-Antikörpers bestätigen, da
dieser auch die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen, aber nicht von
Kontrollbeads blockieren konnte. Des Weiteren wurde untersucht, ob
der von Brown und seinen Mitarbeitern entdeckte Dectin-1 Rezeptor
ein potentieller Phagozytoserezeptor von A. fumigatus-Sporen ist
(Brown et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass Laminarin, ein
lösliches ß 1-3 Glucan, die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen
durch Makrophagen blockierte. Außerdem ließ sich mit einem
anti-Dectin-1 Antikörper die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in
Makrophagen hemmen. Zudem ließ sich Dectin-1 mit diesem Antikörper
in infizierten Makrophagen in der Immunfluoreszenz detektieren. Mit
einem weiteren Antikörper konnte beta-1-3 Glucan, ein wichtiger
Bestandteil der pilzlichen Zellwand, auf ruhenden Sporen detektiert
werden. Es zeigte sich, dass die Menge an  1-3 Glucan eine
wichtige Rolle bei der Eliminierung von A. fumigatus-Sporen spielt.
Vergleiche zwischen ruhenden und angeschwollenen Sporen zeigten,
dass angeschwollene Sporen, welche größere Mengen an ß 1-3 Glucan
auf ihrer Oberfläche besitzen, effizienter phagozytiert werden
können. Auch die A. fumigatus pksP-Mutante, welche mehr  1-3
Glucan auf ihrer Oberfläche besaß, wurde effizienter phagozytiert.
Betrachtet man die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, so
deuten die Daten darauf hin, dass die Dectin-1-gesteuerte
Phagozytose von A. fumigatus-Sporen abhängig von der Syk-Kinase
verläuft. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass
Dectin-1 und TLR2 für eine effiziente Phagozytose von A.
fumigatus-Sporen benötigt werden. Die Ergebnisse legen allerdings
nahe, dass außer Dectin-1 und TLR 2 noch weitere Rezeptoren bei der
Phagozytose von A. fumigatus-Sporen beteiligt sind. Ein genaues
Verständnis der bei der Phagozytose ablaufenden Erkennungsprozesse
und der nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden könnte in
Zukunft ausgenutzt werden, um die Effiziens der Phagozytose auch in
immungeschwächten Patienten zu erhöhen und sie so zu schützen.