Untersuchungen zur Zellkernarchitektur

Verschiedene Arbeiten der letzten Jahre konnten zeigen, dass sich
in vielen, verschiedenen Zelltypen genreiches, transkriptionell
aktives und früh replizierendes Chromatin bevorzugt im Inneren der
Zellkerne aufhält, während das genarme, transkriptionell inaktive
und spät replizierende Chromatin vorrangig an der
Zellkernperipherie zu finden ist. Dennoch ist bislang noch nicht
wirklich verstanden, welche der Chromatineigenschaften, wie die
lokale Gendichte, die Expression oder die Replikationszeit,
tatsächlich einen ausschlaggebenden Einfluss auf die räumliche
Anordnung im Zellkern haben und welche dieser Eigenschaften nur
aufgrund ihrer Korrelation mit diesen „dominanten“ Merkmalen eine
spezifische Verteilung im Interphasekern aufweisen. Um dieses
Problem zu untersuchen, stellten wir Pools aus BAC Klonen von HSA
11, 12, 18 und 19 für R-und G-Banden-spezifische Regionen,
genreiche bzw. genarme Segmente sowie für hoch bzw. niedrig
exprimierte Gene zusammen. Mit Hilfe der multicolor 3D-FISH
Technik, Bildverarbeitung und computergestützter, quantitativer
Auswertungen wurde die Lage dieser BAC Pools im Zellkern sowie ihre
Anordnung bezüglich ihrer Chromosomenterritorien analysiert. Sowohl
in den humanen Lymphozyten wie in den humanen Fibroblasten fanden
wir den R-Banden Pool, den genreichen Pool sowie den Pool, der die
hoch exprimierten Gene enthielt, weiter im Zellkerninneren als ihre
jeweils korrespondierenden Pools (G-Banden, genarmer Pool, bzw.
niedrig exprimierte Gene). Für jeden BAC Pool wurde mittels
sorgfältiger Datenbankrecherche die mittlere lokale Gendichte, der
mittlere GC Gehalt, die Replikationszeit sowie das mittlere
Expressionsniveau bestimmt. Anschließend wurde eine
Korrelationsanalyse dieser Parameter mit der berechneten mittleren,
relativen Position der Pools im Zellkern durchgeführt. Die höchste
Korrelation ergab sich für die Gendichte, während wir zeigen
konnten, dass das Expressionsniveau, die Zuordnung zu einer R- oder
G.Bande, sowie das Replikationstiming offensichtlich so gut wie
keinen Einfluss auf die radiale Anordnung des Chromatins im
Zellkern hat. Diese radiale Positionierung der verschiedenen Pools
spiegelte sich auch in ihrer Anordnung bezüglich der
Chromosomenterritorien wieder. Diese zeigen eine polare Anordnung
in Bezug auf den Zellkern: Genreiche Segmente waren zum Mittelpunkt
des Zellkerns hin orientiert, während die genarmen Segmente in der
Hälfte des CTs zu finden waren, die sich in Richtung der Peripherie
erstreckte. Etwas weniger deutlich ausgeprägt wurde diese Anordnung
auch für die R-/G-Banden Pools sowie für die von der
transkriptionellen Aktivität abhängigen Pools beobachtet. Dies
spricht für eine deutliche strukturelle Transformation bei der
Umwandlung der Metaphasenchromosomen zu den CTs der Interphase, die
Territorien haben eine hohe Plastizität. Wir konnten bestätigen,
dass die extrem genreiche und hoch transkriptionell aktive Region
11p15.5 oft weit aus ihrem CT herausragt. Ein ähnliches Verhalten
konnte jedoch nicht für die ebenfalls sehr genreichen und
transkriptionell aktiven Segmente des Chromosoms 12 beobachtet
werden, was gegen die Annahme spricht, das dieses Phänomen des
„looping outs“ ein typische Anordnung für Chromatinabschnitte mit
solchen extremen Eigenschaften ist. Wir konnten ebenfalls keine
Unterschiede für die Verteilung der BAC Pools der Chromosomen 12,
18 und 19 bezüglich der Oberfläche der CTs finden. R- und G-Banden,
genreiche und genarme Segmente sowie hoch und niedrig exprimierte
Gene scheinen gleichmäßig im gesamten Territorium verteilt zu sein.
Die äußere, das CT einschließende Oberfläche scheint entgegen der
Erwartung offensichtlich kein wichtiger Reaktionsort für besonders
genreiche bzw. hoch exprimierte Sequenzen zu sein.