Vergleichende Untersuchung der regulierten Genexpression von integrierter und episomaler HIV-1 LTR

Erkenntnisse zur funktionalen Zellkernarchitektur wurden bisher
überwiegend an fixierten Zellen durch in situ Methoden erlangt.
Durch Etablierung eines Lebendzell-Systems sollte überprüft werden,
ob es möglich ist, ein einzelnes Transgen auf DNA-Ebene zu
visualisieren und es bei seiner transkriptionellen Aktivierung zu
beobachten. Das hier entwickelte „Gene Positioning System“ (GePS)
nutzt das Lac-Operator/Lac-Repressor-GFP-System („Gene Tag“) als
visualisierende Komponente, um das Indikatorgen auf DNA-Ebene
sichtbar zu machen. Das Indikatorgen selbst basiert auf der
induzierbaren Transkriptionseinheit von HIV-1, die spezifisch durch
das virale Protein Tat aktiviert werden kann und die Transkription
eines Reportergens (DsRed) kontrolliert. Im transient
transfizierten Status konnte das Indikatorgen als Episom durch
Bindung des „Gene Tags“ als punktförmiges Signal im Kern detektiert
werden. In den etablierten und charakterisierten Zelllinien
HeLa-Indi war dies durch Bindung des „Gene Tags“ an 64
Lac-Repressor-Bindungsstellen eines einzelnen Transgens nicht
möglich. Die Etablierung der stabilen Zelllinien und die transiente
Expression ermöglichten einen direkten Vergleich der Transkription
von der integrierten und episomalen HIV-1 LTR. In beiden Fällen
konnte eine spezifische Transkriptionsaktivierung durch Tat auf
Protein- und RNA-Ebene beobachtet werden. Auch eine Tat-unabhängige
Basisaktivität in Form von Volllänge-Transkripten konnte immer
nachgewiesen werden, die in verschiedenen Zelllinien und dem
episomalen Indikatorgen aber zu keiner nachweisbaren
Proteinexpression führte. Die induzierte Expression des
Indikatorgens des „GePS“ konnte darüber hinaus in wichtigen HIV-1
Zielzellen (CD4 positive Lymphozyten) gezeigt werden. Des Weiteren
konnten Erkenntnisse über die Tat-induzierte, von der HIV-1 LTR
ausgehenden Transkription und der Zusammenhang zum Spleißen
gewonnen werden. Durch quantitative PCR wurde deutlich, dass sowohl
im epsiomalen als auch integrierten Status erst durch die
gesteigerte Transkription das Spleißen der Indikatorgen-RNA
induziert wird, das Spleißen also co-transkriptionell stattfindet.
Tat selbst spielt bei der Rekrutierung von Spleißfaktoren nur eine
indirekte Rolle, da durch die transkriptionsdefiziente Mutante
Tat(K41A) kein Spleißen initiiert wird. Durch verschiedene
methodische Ansätze wurde versucht, die Frage der
Chromatinzusammensetzung von nicht replizierenden Episomen in
menschlichen Zellen zu beantworten. Weder durch eine
Colokalisations-Untersuchung noch eine Chromatin IP konnte jedoch
eine spezifische Assoziation des episomalen Indikatorgens mit dem
Histon H3 nachgewiesen werden. Eine Bindung von Proteinen an die
Episomen konnte am Beispiel von p50, einer Untereinheit des
Transkriptionsfaktors NFκB, gezeigt werden. Für die produktive
Replikation der Retroviren ist die Integration der proviralen DNA
ins Genom der Wirtszelle nötig, jedoch konnte für HIV gezeigt
werden, dass nicht integrierte zirkuläre HIV-DNA in sich nicht
teilenden Zellen persistiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit
unterstützen die Vermutung, dass nicht integrierte retrovirale DNA
transkribiert werden kann und dadurch die exprimierten Proteine
Bedeutung für den Lebenszyklus von HIV und durch ihre Persistenz
Einfluss auf die Wirtszellen haben können.