Identifizierung und Charakterisierung neuer Interaktionspartner des mitochondrialen Hsp70
Beschreibung
vor 16 Jahren
Mitochondriales Hsp70 spielt eine wichtige Rolle bei der Biogenese
und Funktion von Mitochondrien. Es ist essenziell für den Import,
die Faltung und den Abbau mitochondrialer Proteine. Wie alle
Hsp70-Proteine arbeitet mtHsp70 dabei mit Cochaperonen zusammen. In
dieser Arbeit wurden neue Interaktionspartner von mtHsp70
identifiziert und funktionell charakterisiert. MtHsp70 ist die
zentrale Komponente des Importmotors der TIM23-Translokase, der den
ATP-abhängigen Transport von Proteinen über die Innenmembran der
Mitochondrien vermittelt. Mit Tim14 und Mdj2 wurden in dieser
Arbeit zwei Proteine des Importmotors als J-Cochaperone
identifiziert. Sowohl Tim14 als auch Mdj2 wurden als
MBP-Fusionsproteine aus E. coli gereinigt und stimulierten die
ATPase-Aktivität von mtHsp70. Eine Variante von Tim14 mit einer
Mutation im HPD-Motiv, die die Stimulation der ATPase-Aktivität von
mtHsp70 durch Tim14 verhindert, konnte die Funktion von Tim14 in
Hefezellen nicht übernehmen. Die Entdeckung von membranassoziierten
J-Proteinen im Importmotor macht deutlich, dass mtHsp70 durch die
Stimulation seiner ATPase-Aktivität effizient an ein importiertes
Protein binden kann, sobald dieses die Translokationspore des
TIM23- Komplexes verlässt. Ebenso wird die evolutionäre
Konservierung zwischen dem Importmotor und bakteriellen
Hsp70-Systemen ersichtlich. Der Importmotor der TIM23-Translokase
ist aber eine Ausnahme unter den Hsp70-Systemen, da in diesem
System mit Tim16 eine weitere, regulatorische Komponente
identifiziert werden konnte. Tim16 ist ein J-ähnliches Protein, das
selber keine stimulierende Wirkung auf die ATPase-Aktivität von
mtHsp70 hat, aber die Stimulation von mtHsp70 durch Tim14
reguliert. Dies könnte einen unnötigen Verbrauch von ATP durch
mtHsp70 in Abwesenheit eines Präproteins verhindern. Mit der
Charakterisierung der J- und J-ähnlichen Proteine des Importmotors
wurden wesentliche Erkenntnisse über die Funktionsweise des
Importmotors geliefert. Ein bisher nicht bekanntes Protein wurde
zusammen mit mtHsp70 aus S. cerevisiae gereinigt und anschließend
biochemisch charakterisiert. Dieses Protein, Hep1, ist ein
lösliches Protein der mitochondrialen Matrix. Es interagiert mit
mtHsp70 in seiner nukleotidfreien und ADPgebundenen Form. Für diese
Interaktion ist die ATPase-Domäne von mtHsp70 notwendig. Jedoch
trägt vermutlich auch die PBD zur Bindung von mtHsp70 an Hep1 bei,
da eine solche Bindung nur beobachtet werden konnte, wenn mtHsp70
sowohl die ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Hep1 hat im
Gegensatz zu den bekannten Cochaperonen keinen Einfluss auf den
ATPase- Zyklus von mtHsp70. Allerdings aggregieren in Abwesenheit
von Hep1 mitochondriale Hsp70-Proteine. Diese Aggregation ist
irreversibel und führt zum Verlust der Funktion der mitochondrialen
Hsp70-Proteine. Diese Beeinträchtigung führt wiederum zu Defekten
in Prozessen, die funktionelle mitochondriale Hsp70-Proteine
benötigen. So wurden in ∆hep1- Zellen Defekte im mitochondrialen
Proteinimport und der Biogenese von Eisen-Schwefel- Clustern
beobachtet. Aufgrund dieser Defekte zeigen ∆hep1-Zellen einen
Temperatursensitiven Wachstumsphänotyp. Die Tendenz zur Aggregation
ist spezifisch für mitochondriale Hsp70-Proteine, wobei besonders
die nukleotidfreie Form von mtHsp70 betroffen ist. Im aggregierten
Material ließ sich eine erhöhte Sensitivität der ATPase-Domäne
gegenüber zugesetzter Protease feststellen, was auf eine
Fehlfaltung dieser Domäne deutet. Es wurde eine Region in der
ATPase- Domäne von mtHsp70 identifiziert, die zur Aggregation von
mtHsp70 beiträgt. Durch Austausch dieser Region gegen die
entsprechende Region aus DnaK, dem nächsten nicht mitochondrialen
Verwandten von mtHsp70, konnte ein teilweise funktionsfähiges
Hsp70- Protein hergestellt werden, dessen Löslichkeit nicht mehr
von Hep1 abhängig ist. MtHsp70 aggregiert nur, wenn es sowohl die
ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Die
Interdomänenkommunikation zwischen der ATPase-Domäne und der PBD
von mtHsp70 scheint zur Ausbildung einer instabilen Konformation
notwendig zu sein. Hep1 bindet an mtHsp70 in dieser Konformation
und verhindert somit die Aggregation. Mit Hep1 wurde in dieser
Arbeit ein neuer Typ von Interaktionspartnern mitochondrialer
Hsp70-Proteine entdeckt. Es wirkt als Chaperon für dieses
Hsp70-Proteine, indem es an sie bindet und deren Aggregation
verhindert.
und Funktion von Mitochondrien. Es ist essenziell für den Import,
die Faltung und den Abbau mitochondrialer Proteine. Wie alle
Hsp70-Proteine arbeitet mtHsp70 dabei mit Cochaperonen zusammen. In
dieser Arbeit wurden neue Interaktionspartner von mtHsp70
identifiziert und funktionell charakterisiert. MtHsp70 ist die
zentrale Komponente des Importmotors der TIM23-Translokase, der den
ATP-abhängigen Transport von Proteinen über die Innenmembran der
Mitochondrien vermittelt. Mit Tim14 und Mdj2 wurden in dieser
Arbeit zwei Proteine des Importmotors als J-Cochaperone
identifiziert. Sowohl Tim14 als auch Mdj2 wurden als
MBP-Fusionsproteine aus E. coli gereinigt und stimulierten die
ATPase-Aktivität von mtHsp70. Eine Variante von Tim14 mit einer
Mutation im HPD-Motiv, die die Stimulation der ATPase-Aktivität von
mtHsp70 durch Tim14 verhindert, konnte die Funktion von Tim14 in
Hefezellen nicht übernehmen. Die Entdeckung von membranassoziierten
J-Proteinen im Importmotor macht deutlich, dass mtHsp70 durch die
Stimulation seiner ATPase-Aktivität effizient an ein importiertes
Protein binden kann, sobald dieses die Translokationspore des
TIM23- Komplexes verlässt. Ebenso wird die evolutionäre
Konservierung zwischen dem Importmotor und bakteriellen
Hsp70-Systemen ersichtlich. Der Importmotor der TIM23-Translokase
ist aber eine Ausnahme unter den Hsp70-Systemen, da in diesem
System mit Tim16 eine weitere, regulatorische Komponente
identifiziert werden konnte. Tim16 ist ein J-ähnliches Protein, das
selber keine stimulierende Wirkung auf die ATPase-Aktivität von
mtHsp70 hat, aber die Stimulation von mtHsp70 durch Tim14
reguliert. Dies könnte einen unnötigen Verbrauch von ATP durch
mtHsp70 in Abwesenheit eines Präproteins verhindern. Mit der
Charakterisierung der J- und J-ähnlichen Proteine des Importmotors
wurden wesentliche Erkenntnisse über die Funktionsweise des
Importmotors geliefert. Ein bisher nicht bekanntes Protein wurde
zusammen mit mtHsp70 aus S. cerevisiae gereinigt und anschließend
biochemisch charakterisiert. Dieses Protein, Hep1, ist ein
lösliches Protein der mitochondrialen Matrix. Es interagiert mit
mtHsp70 in seiner nukleotidfreien und ADPgebundenen Form. Für diese
Interaktion ist die ATPase-Domäne von mtHsp70 notwendig. Jedoch
trägt vermutlich auch die PBD zur Bindung von mtHsp70 an Hep1 bei,
da eine solche Bindung nur beobachtet werden konnte, wenn mtHsp70
sowohl die ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Hep1 hat im
Gegensatz zu den bekannten Cochaperonen keinen Einfluss auf den
ATPase- Zyklus von mtHsp70. Allerdings aggregieren in Abwesenheit
von Hep1 mitochondriale Hsp70-Proteine. Diese Aggregation ist
irreversibel und führt zum Verlust der Funktion der mitochondrialen
Hsp70-Proteine. Diese Beeinträchtigung führt wiederum zu Defekten
in Prozessen, die funktionelle mitochondriale Hsp70-Proteine
benötigen. So wurden in ∆hep1- Zellen Defekte im mitochondrialen
Proteinimport und der Biogenese von Eisen-Schwefel- Clustern
beobachtet. Aufgrund dieser Defekte zeigen ∆hep1-Zellen einen
Temperatursensitiven Wachstumsphänotyp. Die Tendenz zur Aggregation
ist spezifisch für mitochondriale Hsp70-Proteine, wobei besonders
die nukleotidfreie Form von mtHsp70 betroffen ist. Im aggregierten
Material ließ sich eine erhöhte Sensitivität der ATPase-Domäne
gegenüber zugesetzter Protease feststellen, was auf eine
Fehlfaltung dieser Domäne deutet. Es wurde eine Region in der
ATPase- Domäne von mtHsp70 identifiziert, die zur Aggregation von
mtHsp70 beiträgt. Durch Austausch dieser Region gegen die
entsprechende Region aus DnaK, dem nächsten nicht mitochondrialen
Verwandten von mtHsp70, konnte ein teilweise funktionsfähiges
Hsp70- Protein hergestellt werden, dessen Löslichkeit nicht mehr
von Hep1 abhängig ist. MtHsp70 aggregiert nur, wenn es sowohl die
ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Die
Interdomänenkommunikation zwischen der ATPase-Domäne und der PBD
von mtHsp70 scheint zur Ausbildung einer instabilen Konformation
notwendig zu sein. Hep1 bindet an mtHsp70 in dieser Konformation
und verhindert somit die Aggregation. Mit Hep1 wurde in dieser
Arbeit ein neuer Typ von Interaktionspartnern mitochondrialer
Hsp70-Proteine entdeckt. Es wirkt als Chaperon für dieses
Hsp70-Proteine, indem es an sie bindet und deren Aggregation
verhindert.
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