Separase: Regulation, Funktion und neue Substrate

Zusammenfassung Die Protease Separase trägt zur Regulation
mitotischer und meiotischer Vorgänge entscheidend bei. Ihre
klassische Funktion ist die Induktion der
Schwesterchromosomen-trennung durch Spaltung des
Cohesin-Proteinkomplexes, der die Schwesterchromatiden von der
S-Phase bis zur Mitose gepaart hält. Separase wird am Ende der
Metaphase durch Ubiquitin-abhängigen Abbau ihres Inhibitors Securin
aktiviert. Ein zweiter Separase-Inhibitionsmechanismus ist die
Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1 („Cyclin Dependent Kinase 1“). Dafür
ist Separase-Phosphorylierung durch Cdk1 notwendig (Stemmann et
al., 2001). In vielen Modellorganismen hat Separase Funktionen, die
über die Anaphase-Induktion hinausgehen. So trägt sie in S.
cerevisiae beispielsweise zur Cdk1-Inaktivierung beim Meiose
I-Meiose II-Übergang bei. Diese Separase-Funktion benötigt die
proteolytische Separase-Aktivität nicht, ist jedoch abhängig vom
Securin-Abbau. Für andere Funktionen der Separase hingegen könnte
die Separase-abhängige Spaltung noch nicht identifizierter
Substrate notwendig sein. In der vorliegenden Arbeit wird deshalb
die Etablierung der IVEC-Methode („In Vitro Expression Cloning“)
zur Identifizierung neuer Separase-Substrate vorgestellt. Mittels
IVEC wurde - basierend auf der proteolytischen Separase-Aktivität -
aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek das
In-vitro-Separase-Substrat GASP isoliert. Des Weiteren wurde die
Separase-Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1 näher untersucht. In der
vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die
Phosphorylierung von Separase durch Cyclin B1/Cdk1 für ihre
Inhibition zwar notwendig, aber nicht hinreichend ist. Nach
Phosphorylierung der Separase assoziiert die Kinase stabil mit der
Protease, und erst diese Komplexbildung führt letztendlich zur
Inhibition der proteolytischen Separase-Aktivität. Cyclin B1/Cdk1
ist also ein nicht-katalytisch wirkender Separase-Inhibitor. Die
zeitlich korrekte Separase-Aktivierung ist für die fehlerlose
Chromosomentrennung essentiell. Da Zellen ohne Securin ihre
Chromosomen jedoch akkurat und zum richtigen Zeitpunkt trennen,
muss es alternative Separase-Inhibitionsmechanismen geben. Die
Separase-Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1-Bindung könnte dieser
gesuchte Securin-unabhängige Mechanismus sein, da der
Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplex in Zellen bereits vor der Anaphase
nachgewiesen werden kann und Cyclin B1 - wie Securin - am Ende der
Metaphase Ubiquitin-vermittelt abgebaut wird. Securin und Cyclin
B1/Cdk1 können nicht gleichzeitig an Separase binden. Die beiden
Inhibitoren sind also Komponenten parallel und nicht konvergent
wirkender Regulationsmechanismen. Die Phosphorylierung von Separase
an Serin 1126 ist für ihre Cyclin B1/Cdk1-abhängige Inhibition
essentiell (Stemmann et al., 2001). Daneben konnte in der hier
vorgestellten Arbeit eine zweite Domäne in Separase identifiziert
werden, die ebenfalls sowohl für die Inhibition der proteolytischen
Separase-Aktivität als auch für die Komplexbildung mit Cyclin
B1/Cdk1 nötig ist. Da diese zweite Cyclin
B1/Cdk1-Bindungsdeterminante Sequenzhomologie zu dem Cdc6-Protein
aufweist, wurde sie CLD („Cdc6 Like Domain“) genannt. Cdc6 ist ein
konserviertes Protein, das in S. cerevisiae
Cdk1-Inhibitionsaktivität besitzt. Dazu bindet es abhängig von der
Phosphorylierung seines Aminoterminus direkt an B-Typ-Cycline, die
sich im Komplex mit ihren Cdks befinden (Mimura et al., 2004).
Durch Phosphatase-behandlung und Mutationsanalyse konnte bewiesen
werden, dass die Interaktion zwischen Separase und Cyclin B1/Cdk1
auch von Phosphorylierung der Protease innerhalb ihrer CLD abhängt.
Dies legt nahe, dass die Separase-CLD wie der Cdc6-Aminoterminus
direkte Kontakte mit der Cyclin-Untereinheit der Kinase ausbildet.
Serin 1126-Phosphorylierung ist dagegen indirekt an der
Kinase-Bindung beteiligt. Denn erstens wird sie nach der
Etablierung des Komplexes für seinen Erhalt nicht mehr benötigt
(Holland et al., 2006), und zweitens ist sie für die Wechselwirkung
zwischen CLD-enthaltenden Separasefragmenten und der Kinase
abkömmlich. Ein zunächst favorisiertes Bindungsmodell, bei dem die
Polo-Kinase an phosphoryliertes Serin 1126 bindet, um danach die
Bindung von Cyclin B1 durch Phosphorylierung der CLD zu vermitteln,
konnte ausgeschlossen werden. Stattdessen bewirkt die
Phosphorylierung von Serin 1126 wohl eine Konformationänderung der
CLD, die dadurch in die Lage versetzt wird, starke Wechselwirkungen
mit der Cyclin B1-Untereinheit der Kinase einzugehen.
Überraschenderweise ist im Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplex auch die
Kinase inaktiv. Diese unerwartete Separase-Funktion als
Cdk1-Inhibitor ist in Oozyten der Maus für den Übergang von der
Meiose I in die Meiose II von entscheidender Bedeutung. Denn die
Inhibition der Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplexbildung durch
Mikroinjektion entsprechender Antikörper in Maus-Oozyten verhindert
den Ausstoß des ersten Polkörpers, d.h., die Eizellen können den
Meiose I-Meiose II-Übergang nicht vollziehen. In diesen Oozyten
sinkt die Cdk1-Aktivität am Ende der Meiose I nicht wie bei
Kontroll-Oozyten ab. Diese persistente Cdk1-Aktivität ist der Grund
für den verhinderten Übergang von Meiose I nach -II, da künstliche
Cdk1-Inhibition in Anwesenheit des inhibitorischen Antikörpers den
Polkörperausstoß wiederherstellt. In mitotischen Zellen steigt der
unter endogenen Bedingungen mit Separase assoziierte Anteil von
Cyclin B1/Cdk1 in der Anaphase - d.h. nach dem Abbau seines
Bindungskompetitors Securin - an. Übertragen auf die Meiose
bedeutet das, dass Securin-Abbau die Induktion der Anaphase mit der
Separase-abhängigen Cdk1-Inaktivierung koppelt.