Analyse der Podozytenfunktion bei glomerulärem Filtrationsversagen.

Die Funktion der Niere basiert auf einer intakten glomerulären
Filtrationseinheit, für deren Aufrechterhaltung den Podozyten eine
tragende Rolle zugeschrieben wird. Podozyten formen die
Schlitzmembran und sind durch ihre anionische Glykokalix für die
größen- und ladungsselektive Filtration des Blutes im Glomerulus
zur Bildung eines proteinfreien Ultrafiltrats verantwortlich.
Podozyten-Schädigung führt zu einem Verlust der
Filtrationsschlitze, zu einem Ablösen der Podozyten von der GBM und
zur Ausscheidung von hochmolekularen Proteinen im Urin
(Proteinurie). Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifikation
von molekularen Regulationsmechanismen. Vorarbeiten zeigten eine
Induktion der ILK bei Podozyten- Schädigung in humanen
Nierenerkrankungen, zwei Tiermodellen und in Podozyten- Zellkultur.
Anhand eines ILK-Inhibitors konnte in vitro gezeigt werden, dass
die ILKInduktion zu einer gesteigerten Proliferation und zu einer
verminderten Zell-Matrix- Adhäsion führt. Durch den Einfluß der ILK
auf GSK-3β wurden Elemente des Wnt- Signaltransduktionsweges
rekrutiert. Die nucleäre Translokation von β-Catenin beeinflusste
auf transkriptioneller Ebene das Schlitzmembranmolekül P-Cadherin
in Podozyten. P-Cadherin wurde auf mRNA- und Protein-Ebene
reprimiert (siehe Abbildung 8.1). Die Applikation des
ILK-Inhibitors in einem Proteinuriemodell verminderte die
strukturellen Schädigungen innerhalb der Glomeruli.
Immunfluoreszenzen und Co-Immunpräzipitationen ermöglichten die
Identifikation eines neuen, cytoskeletalen Interaktionspartners von
ILK, bei dem es sich um das kürzlich beschriebene PDZ-LIM Domänen
Protein CLP-36 (siehe Abbildung 8.1) handelt. In Podozyten wird
CLP-36 an Serin- und Threonin-Resten phosphoryliert. Eine direkte
Phosphorylierung von CLP-36 durch die ILK konnte mit den
verwendeten in vitro Experimenten zunächst nicht nachgewiesen
werden. CLP-36 assoziiert neben FActin mit den
Alpha-Actinin-Isoformen 1 und 4. Die Expression und molekulare
Interaktion von CLP-36 und Alpha-Actinin-4 in Podozyten konnte
bestätigt werden. Mutierte Formen von Alpha-Actinin-4 führen bei
Menschen zu einem Podozyten- Schaden, einhergehend mit starker
Proteinurie.Über die Regulation von nativem Alpha-Actinin-4 und
seinem Interaktionspartner CLP-36 war bei erworbenen
Nierenerkrankungen noch nichts bekannt. Diese sollte im Rahmen
dieser Arbeit untersucht werden. Bei humanen Nierenerkrankungen,
insbesondere bei FSGS-Patienten, fand sich eine deutliche Reduktion
von Alpha- Actinin-4 und CLP-36 Protein bei gleich bleibender
mRNA-Expression. Die Analyse der Primärsequenz beider Moleküle
ergab, dass diese durch Proteasomen degradiert werden könnten. Die
Ubiquitinierung von Alpha-Actinin-4 konnte experimentell bestätigt
werden, für CLP-36 fanden sich Hinweise auf eine
Poly-Ubiquitinierung. Untersuchungen mit dem Translationsblocker
Cycloheximid ergaben eine Halbwertszeit von mehr als 20 Stunden für
beide Moleküle. Bei zusätzlicher Inhibition mit einem
Proteasom-Inhibitor wurde deren proteasomale Degradation
verhindert. Der Verlust beider Proteine bei oxidativem Stress
konnte ebenfalls durch Inhibition der Proteasomen unterbunden
werden. In dem murinen Proteinuriemodell entsprach die Regulation
von CLP-36 und Alpha-Actinin-4 auf Protein- und mRNA-Ebene den
Befunden an Patientenmaterial. Die Inhibition der Proteasome
blockierte den Verlust von Alpha-Actinin-4 Protein in vivo. Die
vorgestellten Daten identifizieren neue molekulare
Regulationsmechanismen bei Podozyten-Schädigung und leisten einen
Beitrag zum besseren Verständnis der zellulären Prozesse bei
Nierenerkrankungen.