Charakterisierung der transkriptionellen Aktivierung des cadBA-Operons durch den Transmembranregulator CadC aus Escherichia coli

Das Cad-System von Escherichia coli gehört zu den pH-induzierbaren
Aminosäure-Decarboxylase- Systemen. Der Aktivator des Cad-Systems
ist der membrangebundene Transkriptionsregulator CadC. CadC ist
gleichzeitig Sensor für die Umweltreize pH und Lysin, und
Effektorprotein, das die Expression des cadBA-Operons induziert. Im
Rahmen dieser Arbeit wurden der molekulare Mechanismus der
transkriptionellen Aktivierung des cadBA-Operons durch CadC und
verschiedene Modelle für die Aktivierung eines membranintegrierten
Transkriptionsaktivators untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit
konnten durch Footprint-Analysen innerhalb der regulatorischen
Region des cadBA-Operons die zwei CadC-Bindestellen Cad1 (erstreckt
sich von bp -150 bis -112, relativ zum Transkriptionsstart des
cadBA-Operons) und Cad2 (bp -89 bis -59) identifiziert werden.
DNA-Bindeexperimente in vitro zeigten, dass CadC mit einer höheren
Affinität an Cad1 als an Cad2 bindet. Die Affinität von CadC zu
Cad1 und Cad2 wurde durch unterschiedliche pH-Werte oder durch
Lysin und Cadaverin nicht signifikant beeinflusst. Die Analyse der
Bindestellen Cad1 und Cad2 in vivo ergab, dass das Vorhandensein
beider Bindestellen für die Induktion der cadBA-Expression durch
Lysin und einen niedrigen externen pH-Wert essentiell ist.
Desweiteren wurde die Repression des cadBA-Operons unter
nicht-induzierenden Bedingungen durch den globalen Repressor H-NS
untersucht. Deletionsanalysen der regulatorischen Region des
cadBA-Operons indizierten zwei H-NS-Bindestellen stromaufwärts der
CadC-Bindestellen. Rechner-gestützte Sequenzanalysen legten die
Existenz von zwei weiteren H-NS-Bindestellen nahe, die mit den
CadC-Bindestellen und der -35/-10-Region von PCad überlappen. In
hns- Deletionsstämmen war die cadBA-Expression sowohl unter
induzierenden als auch unter nicht-induzierenden Bedingungen
signifikant erhöht. Für die Aktivierung des cadBA-Operons war CadC
essentiell. Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen
zum Oligomerisationszustand von CadC indizierten, dass CadC
Tetramere ausbildet. Die periplasmatische Domäne war für die
Oligomerisierung von CadC essentiell. Die Tetramere traten sowohl
unter induzierenden als auch unter nicht-induzierenden Bedingungen
auf. Daher scheint eine Aktivierung von CadC durch eine
Oligomerisierung von CadC-Monomeren, die durch Umgebungsbedingungen
wie den pH-Wert und die Lysin-Konzentration moduliert wird,
unwahrscheinlich. Basierend auf den oben angeführten Daten wurde
ein Modell für die transkriptionelle Aktivierung des cadBA-Operons
entwickelt. Demzufolge bildet H-NS unter nicht-induzierenden
Bedingungen innerhalb der regulatorischen Region des cadBA-Operons
einen Repressionskomplex. Unter induzierenden Bedingungen bindet
CadC als Tetramer zunächst an die Bindestelle Cad1, wodurch die
anschließende Bindung an Cad2 erleichtert und stabilisiert wird.
Durch die Bindung von CadC wird der H-NS vermittelte
Repressionskomplex aufgelöst, wodurch eine Interaktion der
RNA-Polymerase mit der -35/-10-Region von PCad und die
cadBA-Transkription ermöglicht werden. Verschiedene
membranintegrierte Transkriptionsfaktoren in eukaryontischen Zellen
werden durch eine Regulierte Proteolyse (RP) aktiviert.
Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zum
molekularen Mechanismus des membran-integrierten
Transkriptionsaktivators CadC ergaben bisher keine Hinweise darauf,
dass CadC unter induzierenden Bedingungen durch einen Mechanismus
ähnlich den der Regulierten Proteolyse aktiviert wird. Um die
Funktion der Transmembrandomäne und der periplasmatischen Domäne
für die Aktivierung von CadC genauer zu analysieren, wurden
verschiedene C-terminal verkürzte CadC-Derivate hinsichtlich ihrer
Funktionalität untersucht. Dabei zeigte sich, dass eine
Membranassoziation oder -integration von CadC für die Induktion der
cadBA-Expression notwendig war. Desweiteren war die
periplasmatische Domäne für die CadC-Aktivierung essentiell. In
Zusammenarbeit mit dem Department für Physik der LMU München wurde
ein in silico Modell für die Regulation der cadBA-Expression
erstellt. Zur Überprüfung des Modells wurde die Expression des
Cad-Systems während einer simulierten Magen-Passage in vivo
analysiert. Die experimentellen Daten stimmten mit dem Modell sehr
gut überein. Das Modell ist also in der Lage, die in vivo-Daten zu
abzubilden. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung
der genauen physiologischen Funktion des Cad-Systems. Es konnte
nachgewiesen werden, dass das Cad-System eine wichtige Funktion für
die Säureresistenz von E. coli bei extremen Säurestress bei
pH-Werten