Kernpositionierung und funktionelle Regulation von Genen der humanen CFTR-Region auf Chromosom 7

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die komplexen Zusammenhänge
zwischen der Kernlokalisation, der transkriptionellen Aktivität und
dem Replikationsverhalten von Zelltyp-spezifisch regulierten Genen
in menschlichen Zellen besser zu verstehen. Im ersten Teil dieser
Arbeit wurde die Kernlokalisation der drei benachbarten, jedoch
funktionell unabhängigen Gene GASZ, CFTR und CORTBP2 der humanen
CFTR-Region auf Chromosom 7q31 ermittelt und mit dem
Expressionsverhalten verglichen. Durch eine 2D-Erosionsanalyse
wurde die radiale Positionierung dieser Gene in einer Reihe von
Zelllinien und primären Zelltypen untersucht. Die Ergebnisse haben
gezeigt, dass transkriptionell aktive Gene der CFTR-Region
bevorzugt im Zellkerninneren lokalisierten, nicht exprimierte Gene
waren dagegen eng mit der Kernperipherie assoziiert. Die
benachbarten Genloci wiesen dabei eine voneinander weitgehend
unabhängige Lokalisation auf. Unter Verwendung hoch auflösender
konfokaler Mikroskopie und dreidimensionaler Bildrekonstruktion
konnte diese Korrelation durch eine 3D-Erosionsanalyse im
Wesentlichen bestätigt werden. Um zu ermitteln, ob die
unterschiedlich positionierten Genloci mit verschiedenen
Chromatin-Fraktionen assoziiert sind, wurde eine
Kolokalisationsanalyse vorgenommen. Die Daten haben gezeigt, dass
inaktive Genloci der CFTR-Region zu einem hohen Anteil mit dem
perinukleären Heterochromatin assoziiert sind, aktive Genloci
lokalisierten dagegen bevorzugt in dem hyperazetylierten
Euchromatin im Kerninneren. Mehrfarben-FISH Experimente haben
gezeigt, dass die eng benachbarten Genloci entsprechend ihrer
transkriptionellen Aktivität simultan mit unterschiedlichen
Bereichen im Zellkern assoziiert sein können und vermutlich die
intergenischen Bereiche zwischen den Genen als flexible Linker
dienen. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen im Gegensatz zu früheren
Studien (Sadoni et al., 1999; Volpi et al., 2000; Williams et al.,
2002; Mahy et al., 2002) die Vermutung nahe, dass die
Positionierung subchromosomaler Regionen auf der Ebene einzelner
Gene reguliert wird. Durch die Behandlung der Zellen mit TSA wurde
außerdem gezeigt, dass eine erhöhte Histonazetylierung zu der
Dissoziation eines inaktiven Genlokus von heterochromatischen
Bereichen führt, die transkriptionelle Aktivität davon jedoch nicht
beeinflusst wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde untersucht,
welcher funktionelle Zusammenhang zwischen dem
Replikationsverhalten von GASZ, CFTR und CORTBP2 und der
transkriptionellen Aktivität und Kernlokalisation dieser Gene
besteht. Die Bestimmung der Replikationszeitpunkte wurde durch die
Untersuchung des Auftretens von FISH-Dubletten während definierter
S-Phase Stadien vorgenommen. Da bei dieser Analyse die Möglichkeit
besteht, den Anteil an Dubletten durch eine verlängerte
Schwester-Chromatid Kohäsion zu unterschätzen (Azuara et al.,
2003), wurden die ermittelten Zeitpunkte darüber hinaus durch
verschiedene Fixierungsmethoden überprüft. Die Ergebnisse haben
gezeigt, dass transkriptionell aktive Genloci, die in dem
hyperazetylierten Euchromatin lokalisierten, zu einem früheren
Zeitpunkt replizierten als nicht exprimierte Genloci, die eng mit
dem perinukleären Heterochromatin assoziiert waren. Durch eine
TSA-Behandlung der Zellen wurde nachgewiesen, dass vor allem die
Assoziation mit definierten Chromatin-Fraktionen einen Einfluss auf
das Replikationsverhalten ausübt, die transkriptionelle Aktivität
und das Replikationsverhalten jedoch nur indirekt miteinander in
Zusammenhang stehen. Auf der Basis dieser Daten und früherer
Studien wurde ein Modell erstellt, das die epigenetischen
Mechanismen zueinander in Beziehung setzt, die an der Aktivierung
Zelltyp-spezifisch regulierter Gene beteiligt sind. Der letzte Teil
dieser Arbeit war der Frage gewidmet, ob Komponenten der
Zellkernlamina an der perinukleären Positionierung des reprimierten
CFTR-Lokus beteiligt sind. Dazu wurden HeLa S6 Zellen mit Lamin
A/C-, Lap2- oder Emerin-siRNAs transfiziert. Nach erfolgreichem
Knockdown wurde die Kernlokalisation des CFTR-Lokus durch
Erosionsanalysen und Abstandsmessungen zu der Kernperipherie
ermittelt. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass nach dem Knockdown
von Lamin A/C, Lap2 oder Emerin der CFTR-Lokus signifikant weiter
im Kerninneren lokalisierte. Dabei schienen Lamin A/C und Lap2
einen stärkeren Einfluss auf die Lokalisation von CFTR auszuüben
als Emerin. Auch wenn in früheren Arbeiten bereits gezeigt wurde,
dass die Kernlamina für die Positionierung peripheren Chromatins
von Bedeutung ist (Sullivan et al., 1999; Goldman et al., 2004;
Zastrow et al., 2004), konnte hier zum ersten Mal ein direkter
Einfluss auf die Lokalisation eines einzelnen Genlokus demonstriert
werden. In einem ergänzenden Ansatz wurde die Kernlokalisation von
CFTR in Fibroblasten von HGPS-Patienten untersucht, die auf Grund
der Akkumulation von mutiertem Lamin A/C Deformationen der
Zellkernlamina und Zellzyklus-Defekte aufwiesen (Eriksson et al.,
2003; Goldman et al., 2004). Durch Abstandsmessungen zu der
Kernperipherie und durch Kolokalisationsanalysen wurde gezeigt,
dass der CFTR-Lokus in HGPS-Zellen einen größeren Abstand zur
Kernperipherie aufwies und häufiger im hyperazetylierten
Euchromatin lokalisierte als in Fibroblasten eines gesunden
Probanden. Insgesamt unterstützen diese Daten die Vermutung, dass
die Misslokalisation von reprimierten Genen in ein verändertes
Chromatin-Umfeld an dem Krankheitsbild dieser und anderer
Laminopathien beteiligt sein könnte.