Endothellzellproliferation und die Identifizierung neuer pro-angiogener Gene durch ein neuartiges Hochdurchsatz-Screen-System

Das Blutgefäßsystem eines Organismus stellt eines der größten
Organe des menschlichen Körpers dar. Den Grundbaustein der Gefäße
bilden Endothelzellen, die durch eine einfache Zellschicht das
gesamte System von innen auskleiden. Bei einer Vielzahl an
physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, wie
beispielsweise dem weiblichen Menstruationszyk¬lus, der
Wundheilung, den Entzündungsreaktionen oder aber der Ischämie und
der Tumorpro¬gression, spielt das Endothel eine wesentliche Rolle.
Die Aktivierung der Endothelzellen wird durch zahlreiche
verschiedene Faktoren reguliert, die entweder im Blut zirkulieren,
von be¬nachbarten Zellen oder aber auch von Tumorzellen sezerniert
werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein
Hochdurchsatz-Screen etabliert, bei dem sich Gene mit einem
pro-angiogenen Effekt identifizieren lassen. Hierzu erfolgte die
individuelle Transfektion und Expression von 34.596 verschiedenen
cDNAs in HEK 293-Zellen. Zur Testung wurden deren konditionierte
Medienüberstände auf primäre Endothelzellen (HUVECs) transferiert.
Zwei bereits aus der Literatur bekannte pro-angiogene Faktoren,
bFGF und VEGF, wurden zur Protokoll-Etablierung als
Positivkontrollen eingesetzt. Im Screen konnten insgesamt 13 cDNAs
identifiziert werden, die einen pro-angiogenen Ef¬fekt zeigten.
Unter ihnen fanden sich auch die zwei Positivkontrollen wieder, was
einen direkten Beleg für die Funktionalität des Screens darstellt.
Des Weiteren wurden vier bekannte und fünf unbekannte cDNAs
identifiziert, bei denen bisher noch kein Zusammenhang mit
Angiogenese gezeigt werden konnte. Die vier bekannten Gene kodieren
für zytosolisch lokali¬sierte Proteine, deren Expression in
verschiedene Säuger-Zellen zur Produktion und Sekretion
pro-angiogener Faktoren führt. Im Anschluss an den Screen wurde
eines der unbekannten Gene (NM_020746) detaillierter
charakterisiert. Dieses Gen kodiert für ein 56,6 kDa großes
Protein, das aufgrund erster Funk¬tionshinweise den Namen hSEP
(human Stimulator of Endothelial Proliferation) erhielt. Die
Expression von hSEP in HEK 293-, sowie in anderen Säuger-Zellen,
generierte konditionierte Überstände, welche in Mangelmedium
gehaltene Endothelzellen, nicht aber Fibroblasten zum Wachstum
stimulieren. Mit Hilfe biochemischer Analysen wurde die Sekretion
von hSEP nach der Expression in HEK 293-Zellen nachgewiesen.
Besondere Bedeutung bei der Lokali¬sierung des Proteins kam hierbei
einer bioinformatisch vorhergesagten C-terminalen
Trans¬membrandomäne zu. Die Deletion dieser Domäne erzeugte ein
deutlich effektiver sezerniertes Protein-Fragment (SEP1-510),
führte allerdings gleichzeitig zu einem signifikanten Rückgang der
Wachstums-Stimulation bei HUVECs. Des Weiteren ging die für hSEP
nachgewiesene Lokalisierung im Golgi und ER zu Gunsten einer
diffusen intrazellulären Verteilung verloren. Um den
Wirkungsmechanismus von hSEP aufzuklären, wurden verschiedene
Experimente durchgeführt. Expressionsanalysen von HEK 293-Zellen,
die hSEP exprimierten, zeigten die Induktion verschiedener
pro-angiogener Gene wie beispielsweise IL-8, RANTES und VEGF. Des
Weiteren korrelierte die Anwesenheit von hSEP im Überstand nicht
reproduzierbar mit der Stimulation von HUVECs. Außerdem gelang es
nicht, aktives hSEP-Protein rekombinant zu erzeugen, welches für
einen direkten Beweis seiner Funktionalität erforderlich gewesen
wäre. Darüber hinaus wurden Hinweise auf eine Ko-Expression von
hSEP mit VEGF unter hypoxischen Bedingungen sowie in verschiedenen
soliden Tumoren gefunden. In welchen Zusammenhang die Expression
dieser beiden Proteine steht, müssen weitere detaillierte
Un¬tersuchungen zeigen. Insgesamt ist es denkbar, dass hierdurch
neue mögliche therapeutische Ansätze für eine Inhi¬bition bei der
Tumorangiogenese eröffnet werden könnten.