Identifizierung und Charakterisierung neuer Interaktoren des von Hippel-Lindau Tumorsuppressors
Beschreibung
vor 18 Jahren
Die Inaktivierung des von Hippel-Lindau (VHL) Tumorsuppressors
spielt eine Rolle in der Entstehung von verschiedenen gut- und
bösartigen Tumoren mit hoher Gewebespezifität. Als
substraterkennende Untereinheit des CBCVHL Ubiquitin Ligase
Komplexes steuert VHL den sauerstoffabhängigen Abbau des
Transkriptionsfaktors HIF1/2α. HIF1/2α aktiviert die Transkription
einer Vielzahl von Faktoren, die für den Energiehaushalt der Zelle
und die Blutgefäßneubildung von entscheidender Bedeutung sind. Die
Akkumulation von HIF1/2α führt zu deren konstitutiver Expression
und fördert somit das Wachstum von Tumoren durch eine verbesserte
Nährstoffversorgung. Der sauerstoffabhängige Mechanismus der
HIF-Erkennung wird durch die Aktivität einer neuen Familie von
Prolylhydroxylasen reguliert, die möglicherweise ihrerseits eine
Reihe von zellulären Substraten haben. Trotz der guten Korrelation
zwischen bestimmten, den HIF-Abbau beeinflussenden VHL-Mutationen
und dem Auftreten von verschiedenen Krankheitssubtypen sind noch
nicht alle Phänotypen im Zusammenhang mit VHL erklärbar. Vor allem
die Identifizierung neuer Substrate für den CBCVHL Komplex ist für
ein umfassendes Verständnis der VHL-Krankheit von Interesse. In
dieser Arbeit wurden unterschiedliche Methoden zur Identifizierung
neuer Substrate von VHL angewendet. Durch Affinitätschromatographie
mit einem rekombinanten Komplex aus VHL, Elongin B und Elongin C
(VCB) konnte Daxx als neuer Interaktor von VHL identifiziert
werden. Daxx bindet Elongin B/C-unabhängig an VHL, und seine
Stabilität wird nicht durch VHL reguliert. Zudem bildet Daxx einen
Komplex mit dem VHL-Substrat HIF1α. Dies weist auf eine mögliche
Funktion von VHL neben seiner Rolle als Ubiquitin Ligase hin, z.B.
in der Regulation von Daxx als transkriptionellem Repressor. In
einem funktionalisierten „TwoHybrid“-Screen konnte der Mechanismus
der HIF-Regulation in S. cerevisiae rekonstituiert werden. Dies
ermöglichte die Identifizierung weiterer potentieller
VHL-Substrate, unter anderem Diacylglycerol Kinase iota (DGKι).
DGKι weist zwei Erkennungsmotive für Prolylhydroxylasen auf und
wird in Gehirn und Retina exprimiert. In diesem Organen kommt es
bei VHL-Patienten zur Entstehung von Hämangioblastomen. DGKι wird
in vivo ubiquityliert und bindet sowohl an VHL, als auch an zwei
der drei bekannten Prolylhydroxylasen. Mit Mutanten von DGKι konnte
allerdings gezeigt werden, dass Bindung und Ubiquitylierung nicht
über den gleichen Mechanismus erfolgen wie bei HIF1α.
Möglicherweise spielen Ubiquitylierung und VHL-Bindung getrennte
Rollen in unterschiedlichen zellulären Prozessen. Es wird zunehmend
deutlicher, dass VHL nicht nur eine Komponente des CBCVHL Komplexes
bildet, sondern weitere Funktionen in der Zelle erfüllt. VHL spielt
eine Rolle in der Assemblierung der Fibronektinmatrix, der
Regulation von Mikrotubulistabilität und –dynamik und der
Transkriptionskontrolle. Eine weitere Charakterisierung des
nicht-degradativen Einflusses von VHL auf die in dieser Arbeit
beschriebenen Bindungspartner ist nötig, um die zelluläre
Wirkungsweise von VHL vollständig zu verstehen.
spielt eine Rolle in der Entstehung von verschiedenen gut- und
bösartigen Tumoren mit hoher Gewebespezifität. Als
substraterkennende Untereinheit des CBCVHL Ubiquitin Ligase
Komplexes steuert VHL den sauerstoffabhängigen Abbau des
Transkriptionsfaktors HIF1/2α. HIF1/2α aktiviert die Transkription
einer Vielzahl von Faktoren, die für den Energiehaushalt der Zelle
und die Blutgefäßneubildung von entscheidender Bedeutung sind. Die
Akkumulation von HIF1/2α führt zu deren konstitutiver Expression
und fördert somit das Wachstum von Tumoren durch eine verbesserte
Nährstoffversorgung. Der sauerstoffabhängige Mechanismus der
HIF-Erkennung wird durch die Aktivität einer neuen Familie von
Prolylhydroxylasen reguliert, die möglicherweise ihrerseits eine
Reihe von zellulären Substraten haben. Trotz der guten Korrelation
zwischen bestimmten, den HIF-Abbau beeinflussenden VHL-Mutationen
und dem Auftreten von verschiedenen Krankheitssubtypen sind noch
nicht alle Phänotypen im Zusammenhang mit VHL erklärbar. Vor allem
die Identifizierung neuer Substrate für den CBCVHL Komplex ist für
ein umfassendes Verständnis der VHL-Krankheit von Interesse. In
dieser Arbeit wurden unterschiedliche Methoden zur Identifizierung
neuer Substrate von VHL angewendet. Durch Affinitätschromatographie
mit einem rekombinanten Komplex aus VHL, Elongin B und Elongin C
(VCB) konnte Daxx als neuer Interaktor von VHL identifiziert
werden. Daxx bindet Elongin B/C-unabhängig an VHL, und seine
Stabilität wird nicht durch VHL reguliert. Zudem bildet Daxx einen
Komplex mit dem VHL-Substrat HIF1α. Dies weist auf eine mögliche
Funktion von VHL neben seiner Rolle als Ubiquitin Ligase hin, z.B.
in der Regulation von Daxx als transkriptionellem Repressor. In
einem funktionalisierten „TwoHybrid“-Screen konnte der Mechanismus
der HIF-Regulation in S. cerevisiae rekonstituiert werden. Dies
ermöglichte die Identifizierung weiterer potentieller
VHL-Substrate, unter anderem Diacylglycerol Kinase iota (DGKι).
DGKι weist zwei Erkennungsmotive für Prolylhydroxylasen auf und
wird in Gehirn und Retina exprimiert. In diesem Organen kommt es
bei VHL-Patienten zur Entstehung von Hämangioblastomen. DGKι wird
in vivo ubiquityliert und bindet sowohl an VHL, als auch an zwei
der drei bekannten Prolylhydroxylasen. Mit Mutanten von DGKι konnte
allerdings gezeigt werden, dass Bindung und Ubiquitylierung nicht
über den gleichen Mechanismus erfolgen wie bei HIF1α.
Möglicherweise spielen Ubiquitylierung und VHL-Bindung getrennte
Rollen in unterschiedlichen zellulären Prozessen. Es wird zunehmend
deutlicher, dass VHL nicht nur eine Komponente des CBCVHL Komplexes
bildet, sondern weitere Funktionen in der Zelle erfüllt. VHL spielt
eine Rolle in der Assemblierung der Fibronektinmatrix, der
Regulation von Mikrotubulistabilität und –dynamik und der
Transkriptionskontrolle. Eine weitere Charakterisierung des
nicht-degradativen Einflusses von VHL auf die in dieser Arbeit
beschriebenen Bindungspartner ist nötig, um die zelluläre
Wirkungsweise von VHL vollständig zu verstehen.
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