Biogenese mitochondrialer Außenmembranproteine

Die mitochondriale Außenmembran beherbergt eine Vielzahl an
Proteinen, die anhand ihrer Topologie in unterschiedliche Klassen
eingeteilt werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die
Biogenese von zwei Klassen untersucht. Die erste besitzt eine
hydrophile cytosolische Domäne und ist über eine Transmembrandomäne
im N-terminalen Bereich in der Membran verankert. Dieser
N-terminale Bereich enthält die Signalsequenz dieser Proteine und
dient gleichzeitig als Membrananker, weshalb er als
Signal-Anker-Domäne bezeichnet wird. Zu dieser Proteinklasse
gehören die beiden Rezeptorkomponenten des TOM-Komplexes, Tom20 und
Tom70, und in S. cerevisiae das Protein OM45 mit bisher unbekannter
Funktion. Zur Bestimmung der Bedeutung der Signal-Anker-Domäne für
die Funktion des jeweiligen Proteins bzw. zur strukturellen und
funktionellen Charakterisierung dieses Sequenzabschnittes wurde ein
Komplementationsansatz benutzt. Damit konnte gezeigt werden, dass
die Signal-Anker-Domänen mitochondrialer Außenmembranproteine
funktionell austauschbar sind. Folglich spielen sie für die
spezifische Funktion des Proteins nur eine untergeordnete Rolle,
sind allerdings für den Transport zu den Mitochondrien und für die
Verankerung in der Außenmembran von entscheidender Bedeutung. Des
Weiteren konnte ich die strukturellen Elemente bestimmen, die
zusammen mit der Ankerdomäne das topogene Signal bilden. Eine
moderate Hydrophobizität der Transmembrandomäne scheint am
wichtigsten zu sein, um diese Proteine zu Mitochondrien zu
dirigieren. Eine positive Nettoladung in beiden flankierenden
Regionen der Transmembrandomäne erhöht die Effizienz des Transports
zu den Mitochondrien und die Membraneinbaurate, ist aber keine
essenzielle strukturelle Eigenschaft dieses Signals. Zusätzlich zur
Charakterisierung der Signal-Anker-Domänen wurde der
Importmechanismus dieser Proteinklasse untersucht. Dieser ist gemäß
unserer Ergebnisse nicht von den bekannten Importrezeptoren, Tom20
und Tom70, abhängig, benötigt aber sehr wohl die zentrale
Tom-Komponente Tom40. Im Gegensatz zu Vorstufen von Proteinen
interner mitochondrialer Kompartimente und von
beta-Barrel-Proteinen der Außenmembran scheinen die Vorstufen von
Proteinen mit einer Signal-Anker-Domäne nicht über den von Tom40
gebildeten Kanal importiert zu werden. Höchstwahrscheinlich werden
diese Proteine durch andere Teile von Tom40 erkannt und
anschließend an der Protein-Lipid-Interphase in die Membran
eingebaut. Die zweite untersuchte Proteinklasse der mitochondrialen
Außenmembran sind die beta-Barrel-Proteine, welche über mehrere
antiparallele beta-Faltblätter in der Membran verankert sind. Diese
Proteine sind neben Mitochondrien in der Außenmembran von
Chloroplasten und gram-negativen Bakterien zu finden. Zu Beginn
dieser Arbeit war wenig über die Biogenese mitochondrialer
beta-Barrel-Proteine bekannt. Wir konnten zeigen, dass diese
Proteinklasse über einen evolutionär konservierten Weg in
Mitochondrien importiert wird. Beta-Barrel-Proteine werden zunächst
mit Hilfe des TOM-Komplexes zur Intermembranraumseite
transportiert. Von dort werden sie durch einen zweiten oligomeren
Proteinkomplex, den TOB-Komplex, in die Außenmembran eingebaut. Als
erste Tob-Komponente konnten wir das essenzielle Protein Tob55
identifizieren und charakterisieren. Es kann eine Pore in
Lipidmembranen bilden und könnte folglich für die Insertion der
beta-Barrel-Vorstufen in die Außenmembran verantwortlich sein.
Mas37 wurde ebenfalls als Bestandteil dieses Komplexes beschrieben.
Auf der Suche nach weiteren Komponenten konnte ich Tob38 mit Tob55
zusammen reinigen. Tob38 ist wie Tob55 essenziell für das Wachstum
von Hefezellen und für die Funktion des TOB-Komplexes. Es ist auf
der Oberfläche der mitochondrialen Außenmembran lokalisiert. Tob38
interagiert mit Mas37 und Tob55 und ist auch in Abwesenheit von
Mas37 mit Tob55 assoziiert. Der Tob38-Tob55 Kernkomplex bindet
Vorstufen von beta-Barrel-Proteinen und ermöglicht deren Einbau in
die Außenmembran. Die Depletion von Tob38 führt zu stark
verringerten Mengen an Tob55 und Mas37 und die verbleibenden
Proteine bilden keinen Komplex mehr. Der Import von
beta-Barrel-Vorstufenproteinen in Tob38-depletierte Mitochondrien
ist stark beeinträchtigt, wohingegen andere Außenmembranproteine
oder Proteine anderer mitochondrialer Subkompartimente mit gleicher
Effizienz wie in Wildtyp-Organellen importiert werden. Demnach
besitzt Tob38 eine äußerst wichtige und spezifische Funktion bei
der Biogenese von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen. Es könnte
für die Stabilität und Assemblierung des TOB-Komplexes notwendig
sein oder an der Ausbildung einer transienten Assoziation zwischen
dem TOM- und dem TOB-Komplex beteiligt sein und dabei den Transfer
von Vorstufenproteinen erleichtern. Andererseits könnte Tob38 auch
als Regulator der von Tob55 gebildeten Pore fungieren. Mim1 konnte
im Rahmen dieser Arbeit als eine weitere am Import bzw. der
Assemblierung des beta-Barrel-Proteins Tom40 beteiligte Komponente
charakterisiert werden. Die Depletion von Mim1 führt zu stark
verringerten Mengen an assembliertem TOM-Komplex und zur
Akkumulation von Tom40 als niedermolekulare Spezies. Wie alle
mitochondrialen beta-Barrel-Proteine werden die Vorstufen von Tom40
durch den TOB-Komplex in die Außenmembran eingebaut. Mim1 wird
höchstwahrscheinlich nach diesem TOB-abhängigen Schritt benötigt.
Aufgrund der starken Konservierung im Bereich des
Transmembransegments von Mim1 beim Vergleich der Proteinsequenzen
verschiedener Pilze könnte das Protein als eine Art
Membran-Chaperon fungieren. Dabei könnte Mim1 notwendig sein, um
nicht oder teilweise assembliertes Tom40 in einer kompetenten Form
für die Assemblierung mit den kleinen Tom-Proteinen und mit Tom22
zu halten. Mim1 ist weder eine Komponente des TOM-Komplexes noch
des TOB-Komplexes, sondern scheint vielmehr Bestandteil eines
weiteren, bisher nicht charakterisierten Komplexes zu sein.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Mim1 eine spezifische und
unverzichtbare Rolle bei der Assemblierung des TOM-Komplexes
spielt.