DdEB1, DdMoe1 und DdLIS1: drei neue, centrosomale und Mikrotubuli-assoziierte Proteine bei Dictyostelium discoideum

Die Organisation und Dynamik des Mikrotubuli-Cytoskeletts wird von
großen Proteinkomplexen an den plus- und minus-Enden der
Mikrotubuli reguliert. Am minus-Ende befindet sich das Centrosom,
das als Mikrotubuli-organisierendes Zentrum dient. Am plus-Ende der
Mikrotubuli findet sich ein Komplex von Proteinen, der die Dynamik
der Mikrotubuli reguliert sowie ihre Verankerung am Zellcortex
vermittelt. DdCP224 ist ein centrosomales und
Mikrotubuli-assoziiertes Protein bei Dictyostelium discoideum, das
zur ubiquitären XMAP215-Familie gehört und eine wichtige Rolle bei
der Dynamik des Centrosoms und des Mikrotubuli-Cytoskeletts spielt.
Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung zuvor unbekannter
Dictyostelium-Proteine, die mit DdCP224 bei diesen dynamischen
Vorgängen zusammenwirken. Mit DdEB1, DdMoe1 und DdLIS1 konnten drei
neue Mikrotubuli-assoziierte Proteine bei Dictyostelium
identifiziert und charakterisiert werden. Alle drei Proteine
konnten gleichzeitig auch als echte centrosomale Bestandteile
nachgewiesen werden, da ihre Lokalisation am Centrosom unabhängig
von Mikrotubuli ist. DdEB1 ist aufgrund seines Molekulargewichts,
das größte Mitglied der ubiquitären EB1-Proteinfamilie. DdEB1
zeigte eine cytosolische Interaktion mit DdCP224 und Dynein. Am
Beispiel von DdEB1 und DdCP224 konnte in dieser Arbeit nicht nur
erstmals die Interaktion von Proteinen aus der EB1- und
XMAP215-Familie, sondern auch ihre lange vermutete Colokalisation
an Mikrotubuli-plus-Enden nachgewiesen werden. Mit Hilfe der
Expression von GFP-DdEB1-Deletionsmutanten konnte gezeigt werden,
dass die DdEB1 Bindung an Mikrotubuli von einer
Homo-Oligomerisierung des Proteins abhängt, die durch eine
„coiled-coil“-Domäne vermittelt wird. DdEB1-Nullmutanten zeigen in
erster Linie mitotische Defekte, d.h. Störungen der
Centrosomenduplikation, Spindelbildung und Chromosomensegregation.
Die mikroskopische Analyse lebender Zellen ergab, dass DdEB1 für
die Spindelbildung, nicht aber für die Spindelelongation oder die
Mikrotubuli/Zellcortex-Interaktion benötigt wird. Bei der Suche
nach möglichen DdEB1-Interaktoren wurde mit DdMoe1 das
Dictyostelium-Homologe von Schizosaccharomyces pombe Moe1 isoliert,
das dort ein Interaktionspartner des entsprechenden EB1-Proteins
ist. Eine solche Interaktion ist den durchgeführten Untersuchungen
zufolge bei Dictyostelium jedoch unwahrscheinlich. Dafür konnte
hier zum ersten mal ein Moe1-homologes Protein als echte
Centrosomenkomponente identifiziert werden und die
Mikrotubuli-Bindung eines solche Proteins in vivo nachgewiesen
werden. Wie EB1 ist auch das humane LIS1-Protein ein
Mikrotubuli-plus-End und Dynein-assoziiertes Protein. Mutationen in
diesem Gen führen zu einer schweren Entwicklungsstörung des Gehirns
(Lissenzephalie), aufgrund eines neuronalen Migrationsdefekts.
Dictyostelium LIS1 (DdLIS1) bindet nicht nur an Dynein, sondern
auch an DdCP224, womit auch erstmals die Interaktion mit einem
Protein der XMAP215-Familie nachgewiesen werden konnte. DdLIS1
spielt gemeinsam mit Dynein eine Rolle bei der
Mikrotubuli/Zellcortex Verankerung, was in
DdLIS1-Überexpressionsmutanten deutlich wurde. Die Überexpression
von DdLIS1 führte außerdem zur Centrosomenamplifikation, Defekten
bei der Organisation der Mitosespindel, schweren Cytokinesedefekten
und einer drastisch eingeschränkten Zellmotilität. Letztere steht
im Einklang mit dramatischen Veränderungen der Aktindynamik, bei
der charakteristische wandernde Aktin-Polymerisationswellen am
Zellcortex auftreten. Da derselbe Aktin-Phänotyp auch durch
Behandlung von Kontrollzellen mit der F-Aktin depolymerisierenden
Droge Latrunculin A simuliert werden konnte wurde angenommen, dass
die DdLIS1-Überexpression den Aktin-Gehalt beeinflusst. Tatsächlich
konnte in mikroskopischen und biochemischen Nachweisen bestätigt
werden, dass die Überexpression von DdLIS1 den F-Aktin Gehalt der
Zellen vermindert. Das Mikrotubuli-assoziierte Protein DdLIS1 ist
also ein mögliches Bindeglied zwischen dem Mikrotubuli- und
Aktin-Cytoskelettsystem.