Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der Proteintranslokasen der mitochondrialen Innenmembran von Neurospora crassa und Saccharomyces cerevisiae

Die Innenmembran von Mitochondrien besitzt zwei Translokasen für
den Import von Proteinen. Der TIM23-Komplex vermittelt die
Translokation über und in die Innenmembran, der TIM22-Komplex
inseriert Proteine mit mehreren hydrophoben Segmenten in die
Innenmembran. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Komponenten dieser
Translokationsmaschinerien in N. crassa und S. cerevisiae
identifiziert und charakterisiert werden. In N. crassa waren zu
Beginn der Arbeit im Vergleich zu S. cerevisiae nur wenige
Komponenten der TIM-Translokasen bekannt. In der vorliegenden
Arbeit wurden die Proteine Tim22, Tim54 und Tim44 in N. crassa
identifiziert. Dies wurde entweder durch die Verwendung
degenerierter Primer in PCR-Reaktionen mit cDNA aus N. crassa oder
durch Durchmustern von Datenbanken erreicht. Die identifizierten
Proteine des TIM22-Komplexes wurden bezüglich ihrer Lokalisation
und Topologie untersucht. Es handelt sich bei Tim22 um ein
Membranprotein der inneren mitochondrialen Membran mit vier
Transmembranhelices, das sowohl den N- als auch den C-Terminus in
den Intermembranraum exponiert. Tim54 ist ebenso in der inneren
mitochondrialen Membran lokalisiert und besitzt nur eine
Transmembranhelix. Der größte Teil des Proteins liegt im
Intermembranraum, nur wenige Aminosäurereste befinden sich in der
mitochondrialen Matrix. Ferner wurde der TIM22-Komplex von N.
crassa charakterisiert. Dazu zählten die Untersuchungen der
beteiligten Komponenten, der Komplexgröße und der Stabilität des
Komplexes. In N. crassa besteht der TIM22-Komplex aus den
Komponenten Tim22, Tim54, Tim9 und Tim10, die einen etwa 350 kDa
großen Komplex bilden. Für spätere funktionelle Untersuchungen
wurde der TIM22-Komplex bzw. Tim22 alleine gereinigt. Beides wurde
in Lipidvesikel rekonstituiert. Dieses Verfahren bietet die
Grundlage für Untersuchungen in einem definierten experimentellen
System, wie Proteine der Carrier-Familie in Lipidmembranen
inseriert werden. In S. cerevisiae wurde mit Tim16 eine neue
Komponente des mitochondrialen Importmotors des TIM23-Komplexes
identifiziert. Dies konnte durch Koreinigung mit einer weiteren
Komponente des Importmotors, Tim14, erreicht werden. Die
strukturelle Vorhersage für Tim16 ähnelt stark der des J-Proteins
Tim14. Tim16 fehlt allerdings das für die Funktion von J-Proteinen
essentielle HPD-Motiv. Tim16 ist in der mitochondrialen Matrix
lokalisiert und peripher mit der inneren mitochondrialen Membran
assoziiert. Durch Depletion von Tim16 wird der Import von
Substraten in Mitochondrien beeinträchtigt, die vom mitochondrialen
Importmotor abhängig sind. Durch Koimmunopräzipitationen und
Quervernetzungsexperimente wurde Tim16 als neue Komponente des
mitochondrialen Importmotors der TIM23-Translokase definiert.
Funktionell spielt Tim16 eine große Rolle für die Integrität des
Importmotors. Die genaue Struktur des Importmotors, seine
Regulation und dessen Dynamik im Zuge der Translokation von
Präproteinen muss in zukünftigen Experimenten geklärt werden.